(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210582945.3 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 甘肃润牧生物工程有限责任公司 地址 737100 甘肃省金昌市永昌县 朱王堡 镇永清路北侧(永清路8- 6) (72)发明人 乐祥鹏　孔园园　张兆才　李建栋　 李宝胜　孙锦林　宿平平　孙万武　 赵学娣　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种湖羊PLIN2基因SNP的检测方法及其在 肉质性状早期筛 选中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种湖羊PLIN2基因SNP的检 测方法及其在肉质性状早期筛选中的应用。 本发 明通过湖羊组织DNA的提取、 iMLDR技术进行分 型、 等位基因频率与基因型频率计算， 以及将湖 羊背最长肌脂肪酸百分比与 PLIN2基因突变位点 g.287G>A进行关联分析， 揭示了 该位点的多态性 及所存在的与有益脂肪酸百分比显著相关的分 子标记， 为通过标记辅助选择选育优异肉品质的 绵羊新品系提供依据。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114854878 A 2022.08.05 CN 114854878 A 1.一种检测湖羊PL IN2基因单核苷酸多态性的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 以提取的湖羊基因组DNA为模板进行PCR扩增， 对扩增产物包含的单核苷酸多态性位点 进行基因分型， 所述单核苷酸多态性 位点为位于PLIN2基因上的突变位 点g.287G>A。 2.根据权利要求1所述一种检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所述PCR扩增的引物为： 上游引物： 5 ’ ‑GTGAACGCAGCACAGACTC ‑3’ 下游引物： 5 ’ ‑ATGAGAACCACGCCGAAGG‑3’。 3.根据权利要求1或2所述一种检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在 于： 所述PCR扩增的反应体系包括30ng/ μL模板1μL以及10pmol/ μL的上、 下游引物各0.5 μL； PCR扩增的反应程序为： 95℃预变性4min； 94℃变性30s， 63.8℃退火60s， 72℃延伸9 0s， 共34 个循环； 72℃再延伸9mi n。 4.根据权利要求1所述一种检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所述基因分型采用iMLDR技 术。 5.根据权利要求1所述一种检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所述基因 组DNA采用酚 ‑氯仿法提取。 6.根据权利要求1所述一种检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所述突变位点是通过DNA混池测序确定的。 7.一种检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的试剂 盒， 其特征在于： 该试剂盒包括用于 扩增PLIN2基因单核苷 酸多态性位点的引物， 所述单核苷 酸多态性位点为位于PLIN2基因上 的突变位 点g.287G>A。 8.如权利要求1所述的检测湖羊PLIN2基因单核苷酸多态性的方法在绵羊标记辅助选 择育种中的应用。 9.绵羊PLIN2基因突变位点g.287G>A或该突变位点检测试剂在绵 羊标记辅助选择育种 中的应用。 10.根据权利要求8 或9所述的应用， 其特征在于： 具有GG基因型的个体在肉质性状上较 优。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854878 A 2一种湖羊PLIN2基因SNP的检测方 法及其在肉质性状 早期筛选 中的应用 技术领域 [0001]本发明属于分子遗传学检测及育种领域， 具体涉及利用DNA混池测序检测出的湖 羊PLIN2基因单核苷酸多态性(Single  nucleotide  polymorphism,SNP)位点， 并结合荧光 多重酶连接反应(Improved  multiplex  ligation detection  reaction,iMLDR)技术对该 位点进行基因分型及利用分型 结果与脂肪酸百分比进行关联性分析。 背景技术 [0002]单核苷酸多态性(Single  nucleoti de polymorphism,SNP)是生物在遗传变异过 程中最常见的， 同时是生物进化过程中的重要途径。 SNP发生在内含子区的较多， 内含子区 域的SNP不改变基因编码蛋白质的氨基酸序列， 但可能导致选择性剪接或与遗传元件相互 作用， 从而影响基因的转录和翻译效率， 使表型发生改变。 筛选重要性状相关的SNP在遗传 改良等方面具有重要作用。 iMLDR技术是一种 新型高通量SNP基因分型技术， 该技术具有分 型准确率高、 成本低、 速度快、 可同时检测多个SNP位 点等优势。 [0003]脂肪酸是影响肉品质重要的属性之一， 其含量和组成决定了脂肪的质地特性以及 肌肉的氧化稳定性， 影响肉的风味、 嫩度、 保质期等。 脂肪酸按照碳链的长度分为长链脂肪 酸(12个碳以上)、 中链脂肪酸(6 ‑12个碳)、 短链脂肪酸(小于6个碳原子数)。 长链脂肪酸在 食物的甘油三酯 中存在较多， 是细胞膜的重要组成部分。 长链脂肪酸影响畜产品质量及家 畜的生长性能， 牛奶中的脂肪 大多数由长链脂肪酸组成， 长链脂肪酸主要由日粮提供， 极易 受到日粮脂肪酸组成的影响。 长链多不饱和脂肪酸对生长发育至关重要， 且体内的长链多 不饱和脂肪酸可通过饮食补充改善 。 [0004]脂肪分化相关蛋白(Adipose  differentiation ‑related protein,ADRP)属于PAT 蛋白家族， 又称PLIN2， 可特异性地促进长链脂肪酸的摄取。 GAO等研究发现， PLIN2的mRNA和 蛋白质表达水平受长链脂肪酸剂量和刺激时间的影响， 而短链脂肪酸对PLIN2无影响。 Tobin等研究发现， 人胎盘绒毛膜癌细胞系(BeWo)和原代人滋养细胞中PLIN2的mRNA和蛋白 质表达水平随着长链多不饱和脂肪酸浓度的增加而增加。 等用C18:1n9c处理多形性胶 质母细胞瘤 细胞后发现， PL IN2的蛋白质表达量升高。 [0005]尽管PLIN2作为一种脂肪酸结合蛋白， 可以通过充当载体蛋白促进长链脂肪酸的 摄取。 但目前PLIN2基因主要是在脂肪酸诱导细胞水平上得到广泛研究， 尚无绵羊PLIN2基 因SNP影响脂肪酸表型的相关报道， 利用分子标记对具有有益脂肪酸表型优势的个体进行 早期筛选仍属于技 术难题。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种湖羊PLIN2基因SNP的检测 方法及其在肉质性状早期 筛选中的应用。 [0007]本发明的目的是通过以下技 术方案来实现的：说　明　书 1/6 页 3 CN 114854878 A 3