(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210582946.8 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 甘肃润牧生物工程有限责任公司 地址 737100 甘肃省金昌市永昌县 朱王堡 镇永清路北侧(永清路8- 6) (72)发明人 乐祥鹏　孔园园　张兆才　李建栋　 李宝胜　沈先林　郭旭　李国鹏　 冯玉　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种湖羊LPL基因SNP的检测方法及其在肉 质性状早期筛 选中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种湖羊LPL基因SNP 的检测 方法及其在肉质性状早期筛选中的应用。 本发明 通过湖羊组织DNA的提取、 iMLDR技术进行分型、 等位基因频率与基因型频率计算， 以及将湖羊背 最长肌脂肪酸百分比与LPL基因突变位点 g.23413C >T进行关联分析， 揭示了 该位点的多态 性及所存在的与有益脂肪酸百分比显著相关的 分子标记， 为通过标记辅助选择选育优异肉品质 的绵羊新品系提供依据。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114854879 A 2022.08.05 CN 114854879 A 1.一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 以提取的湖羊基因组DNA为模板进行PCR扩增， 对扩增产物包含的单核苷酸多态性位点 进行基因分型， 所述单核苷酸多态性 位点为位于LPL基因上的突变位 点g.23413 C>T。 2.根据权利要求1所述一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所 述PCR扩增的引物为： 上游引物： 5 ’ ‑TGTTCTGAACTTCTGGTTGACT‑3’ 下游引物： 5 ’ ‑CCAATGGCAAGAGGAGAGTAAT‑3’。 3.根据权利要求1或2所述一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所述PCR扩增的反应体系 包括30ng/ μL模板1μL以及10pmol/ μL的上、 下游引物各0.5 μL； PCR 扩增的反应程序为： 95℃预变性4min； 94℃变性30s， 63.8℃退火60s， 72℃延伸90s， 共34个 循环； 72℃再延伸9mi n。 4.根据权利要求1所述一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所 述基因分型采用iMLDR技 术。 5.根据权利要求1所述一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所 述基因组DNA采用酚 ‑氯仿法提取。 6.根据权利要求1所述一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法， 其特征在于： 所 述突变位点是通过DNA混池测序确定的。 7.一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒包括用于扩 增LPL基因单核苷酸多态性位点的引物， 所述单核苷 酸多态性位点为位于LPL基因上的突变 位点g.23413 C>T。 8.如权利要求1所述的检测湖 羊LPL基因单核苷酸多态性的方法在绵羊标记辅助选择 育种中的应用。 9.绵羊LPL基因突变位点 g.23413C>T或该突变位点检测试剂在绵 羊标记辅助选择育种 中的应用。 10.根据权利要求8 或9所述的应用， 其特征在于： 具有TT基因型的个体在肉质性状上较 优。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854879 A 2一种湖羊LPL 基因SNP的检测方 法及其在肉质性状 早期筛选中 的应用 技术领域 [0001]本发明属于分子遗传学检测及育种领域， 涉及利用D NA混池测 序检测出的湖羊LP L 基因单核苷酸多态性(Single  nucleotide  polymorphi sm,SNP)位点， 并结合荧光多重酶连 接反应(Improved  multiplex  ligation detection  reaction,iMLDR)技术对该位点进行 基因分型及利用分型 结果与脂肪酸百分比进行关联性分析。 背景技术 [0002]分子标记被广 泛应用于动 物育种中， 例如通过标记辅助选择对动 物进行选育。 S NP 广泛存在于基因组中， 大约每300bp的序列长度就会 出现一个SNP。 SNP检测技术用于扫描新 的多态性位点， 并确定目标序列中已知多态性的等位基因。 iMLDR技术是一种新型高通量 SNP基因分型技术， 该技术具有分型准确率高、 成本低、 速度快、 可同时检测多个SNP位点等 优势。 [0003]肉类是人们日常生活中食用的基本食物之一， 它含有大量容易消化的蛋白质、 维 生素、 微量元素以及脂肪， 是人体内许多代谢过程正常运作所必需的。 肉品质是一种复杂的 性状， 可以通过不同的属性来定义， 其中脂肪酸是影响肉品质的重要属性之一， 其含量和组 成决定了脂肪的质地特性以及肌肉的氧化稳定性， 影响肉的风味、 嫩度、 保质期、 营养价值 等， 同时脂肪酸是机体的主要能量来源。 脂肪酸的含量和组成受品种、 年龄、 性别、 饲养方 式、 饲料种类等的影响。 脂肪酸按照碳链饱和程度分为饱和脂肪酸(Saturated  fatty  acid,SFA)、 单不饱和脂肪酸(Monounsaturated  fatty acids,MUFA)、 多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated  fatty acids,PUFA)。 SFA中的C6、 C8、 C10 可致使羊肉产生膻味， 且SFA能 增加人体患心血管疾病的风险； MUFA与肉香 味和整体可接受程度呈正相关关系， MUFA还具 有降低血糖、 血脂、 胆固醇水平等功能； PUFA中的n ‑6PUFA和n ‑3PUFA是人体的必须脂肪酸， 且人体自身不能合成， 只能从食物中获取， PU FA对炎症、 高血压、 缺血性中风、 外周动脉疾病 和动脉粥样硬化具有 有利影响。 [0004]脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein  lipase,LPL)是脂肪酸分解过程中的关键酶， LPL介 导的脂蛋白脂解使脂肪酸释放， 并通过血液运输到心脏， 是心脏所需脂肪酸的关键来源。 Wei等研究发现， LPL基因表达量与杜洛克 ×山猪背最长肌中的C16:1、 C18:1n9c及MUFA呈显 著正相关， 与C16:0、 C18:0及SFA呈显著负相关。 Oh等对LPL基因中的SNPs与韩国牛背最长肌 组织中脂肪酸百分比之间的相关性进行研 究， 结果发现LPL基因c.322G>A中AA基因型个体 的C18:1n9 c、 C18:3n3、 MUFA百分比显著高于GG基因型， AA 基因型个体中C14:0、 C16:0、 SFA的 百分比显著低于GG基因型； c.329A>T中AA基因型个体的C18:1n9c、 C18:3n3、 MUFA的百分比 显著高于TT基因型， C16:0、 SFA的百分比显著低于TT基因型， c.322G>A和c.329A>T均对C18: 1n9c、 SFA和MUFA具有累加效应。 除了存在可作为提高杜洛克 ×山猪、 韩国牛肉质量的有效 分子标记， 高鸿蒙等研究发现， LPL基因中的A384T位点对乌珠穆沁羊背最长肌中的C16:0、 C18:0、 C14: 1具有显著影响， 其中TT基因型的C16:0、 C18:0和C14: 1均显著低于TA和AA基因说　明　书 1/6 页 3 CN 114854879 A 3