(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221073419 2.3 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 江苏今世缘酒业股份有限公司 地址 223411 江苏省淮安市 涟水县高沟镇 今世缘大道1号 (72)发明人 申雪敏　季方　吴建峰　孟迎　 纪杨　唐群勇　张丹丹　袁小转　 刘梦夏　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 陈小龙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种检测酵母菌的引物、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测酵母菌的引物、 试剂 盒及方法。 所述检测酵母菌的引物的核酸序列包 括SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的序列。 本发 明设计酵母荧光定量PCR特异性引物， 具备高特 异性， 能够有效应用于酵母实时荧光定量PCR检 测方法， 对酵母菌数进行定量分析， 避免了单拷 贝数和多拷贝数问题， 操作简便、 周期短、 灵敏度 高、 准确性高且特异性强， 适于实践生产应用， 具 有广泛的市场应用前 景。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115029476 A 2022.09.09 CN 115029476 A 1.一种检测酵母菌的引物， 其特征在于， 所述检测酵母菌的引物的核酸序列包括SEQ   ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的序列。 2.权利要求1所述的检测酵母菌的引物在制备检测酵母菌的产品中的应用。 3.一种检测酵母菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述检测酵母菌的试剂 盒包括权利要求1所 述的检测酵母菌的引物。 4.根据权利要求3所述的检测酵母菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述检测酵母菌的试剂 盒 还包括PCR反应液和/或核酸染料； 优选地， 所述PCR反应液包括DNA聚合酶、 Mg2+、 dNTPs和水。 5.权利要求1所述的检测酵母菌的引物在检测酵母菌中的应用。 6.一种检测酵母菌的方法， 其特 征在于， 所述检测酵母菌的方法包括： 以待测样本中基因组为模板， 利用权利要求1所述的检测酵母菌的引物进行PCR， 检测 酵母菌。 7.根据权利要求6所述的检测酵母菌的方法， 其特征在于， 所述PCR包括实时荧光定量 PCR； 优选地， 所述检测酵母菌的方法包括： 取已知酵母菌数的酵母菌的基因组， 进行梯度稀释， 得到不同浓度酵母菌基因组DNA， 利用权利要求 1所述的检测酵母菌的引物进 行实时荧光定量P CR， 以不同浓度酵母菌基因组 DNA的Ct值 为纵坐标， 以对应的酵母菌数的lg为横坐标绘制标准曲线， lg为对数函数； 以待测样本中基因组为模板， 利用权利要求1所述的检测酵母菌的引物进行进行实时 荧光定量PCR， 将得到的Ct值代入所述标准曲线中， 计算待测样本中酵母菌数量。 8.根据权利要求7所述的检测酵母菌的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR的程 序为： 95～ 98℃预变性25～3 5s； 95～98℃变性10s， 5 5～65℃、 25～3 5s， 35～45个循环。 9.根据权利要求7或8所述的检测酵母菌的方法， 其特征在于， 所述已知酵母菌数的酵 母菌的基因 组的制备 方法包括： 将酿酒酵母接种于培养基 中培养， 取菌液， 利用血球计数板进行计数， 计算出每mL菌液 中的酿酒酵母数， 并提取 酵母基因 组。 10.根据权利要求7或8所述的检测酵母菌的方法， 其特征在于， 所述检测酵母菌的方法 包括以下步骤： (1)将酿酒酵母接种于培养基中培养， 取菌液， 利用血球计数板进行计数， 计算出每mL 菌液中的酿酒酵母数， 并提取 酵母菌基因 组； (2)对步骤(1)提取酵母菌基因组到进行梯度稀释， 得到不同浓度酵母菌基因组DNA， 利 用权利要求1所述的检测酵母菌的引物进行实时荧光定量PCR， 以不同浓度酵母菌基因组 DNA的Ct值 为纵坐标， 以对应的酵母菌数的lg为横坐标绘制标准曲线， lg为对数函数； 以待测样本中基因组为模板， 利用权利要求1所述的检测酵母菌的引物进行进行实时 荧光定量PCR， 将得到的Ct值代入所述标准曲线中， 计算待测样本中酵母菌数量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029476 A 2一种检测酵母 菌的引物、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于 实时荧光定量PC R技术领域， 涉及一种检测酵母菌的引物、 试剂盒及方 法。 背景技术 [0002]白酒酿造过程中微生物对其有着至关重要的作用， 但由于白酒酿造过程是一个多 菌种的固态发酵过程， 无论酒曲还是酒醅中都含有复杂的微生物混合群落体系。 由于这种 白酒酿造环境的复杂性， 导致了采用传统微生物分离计数方法很难对其中微生物进行全面 和准确定量， 因此传统的分离培养计数方法已远远不能满足目前微生物复杂群落体系研究 的需要。 采用传统的分离培养计数方法很难深入研究其微生物群落结构及变换规律， 解决 其混合体系中各菌种比例问题。 而采用目前的分子生物学能克服传统分离培养计数方法的 局限， 为白酒酿酒过程中的微 生物研究开辟了新的研究方向。 [0003]酵母菌是白酒酿造过程中一类非常重要的微生物， 主要进行酒精发酵。 其中酿酒 酵母是白酒生产过程中的酒精发酵主体菌， 其发酵能力直接影响原料 的出酒率， 酒精发酵 的副产物如酸类、 酯类、 醇类又影响其白酒风味， 在白酒生产中具有重要作用。 [0004]实时荧光定量PCR技术作为一种灵敏度高、 特异性强的检测手段， 因具有操作简便 快速、 专一性强和准确度高的特点， 目前已被广泛应用到定量复杂环境中微生物数量方面。 就目前而言， 实时荧光定量PCR技术已经得到很大的发展， 但也存在一定的问题， 现有的Ct 循环数与拷贝 数对数的标曲在实际应用中难以解决单拷贝和多拷贝的问题， 不利于生产实 践应用， 如CN1015 55527A公开用于荧 光定量PCR法检测肠道酿酒酵母菌的试剂盒。 [0005]综上所述， 如何提供一种高效、 操作简便且能够对酵母菌数量进行准确定量的检 测方法， 是白酒生产工艺控制中亟需解决问题之一。 发明内容 [0006]针对现有技术的不足和实际需求， 本发明提供一种检测酵母菌 的引物、 试剂盒及 方法， 设计酵母荧光定量P CR特异性引物， 并提供了一种酵母实时荧光定量P CR检测方法， 采 用此方法对白酒酿造过程中的酵母菌数进行定量分析， 避免了单拷贝数和多拷贝数问题。 [0007]为达上述目的， 本发明采用以下技 术方案： [0008]第一方面， 本发明提供一种检测酵母菌 的引物， 所述检测酵母菌的引 物的核酸序 列包括SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的序列。 [0009]本发明设计酵母荧光定量PC R特异性引物， 具备高特异性， 能够有效应用于酵母实 时荧光定量P CR检测方法， 采用此方法对酵母菌数进 行定量分析， 避免了单拷贝 数和多拷贝 数问题， 且操作简便。 同时， 探究其生物量变化规律， 对了解不同酵母在发酵过程中的变化 情况及白酒生产工艺控制具有重要意 义。 [0010]SEQ ID NO.1(上游引物)： 5 ’ ‑GAAGACAAGAGATGGAGAGTC‑3’。 [0011]SEQ ID NO.2(下游引物)： 5 ’ ‑TTGTCCTATAACAAAAGCACAG‑3’。说　明　书 1/6 页 3 CN 115029476 A 3