(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210596142.3 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号 (72)发明人 宋雪梅　燕飞　曹宇浩　严丹侃　 韩科雷　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种检测辣椒轻斑驳病毒和炭疽菌的引物 组、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明涉及植物病毒、 病菌生物检测技术领 域， 具体涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增 技术(RT‑RAA)检测辣椒轻斑驳病毒和炭疽菌的 引物组、 试剂盒及方法。 本发明中所设计的检测 PMMoV的正向引物PM ‑F2的序列如SEQ  ID No.1所 示， 反向引物PM ‑R2的序列如SEQ  ID No.2所示， 探针引物PM ‑P3的序列如SEQ  ID No.3所示， 所设 计的检测炭疽菌的正向引物CT ‑F1的序列如SEQ   ID No.4所示， 反向引物CT ‑R1的序列如SEQ  ID  No.5所示， 探针引物 CT‑P1的序列如SEQ  ID No.6 所示， 本发明引物组可以有效扩增PMMoV的CP基 因、 炭疽菌组蛋白的H3基因， 引物组具有较高的 特异性和灵敏性， 与其他病毒或细菌无交叉反 应， 可与侧向流免疫层析联合使用用于植物 PMMoV和炭疽菌的现场快速检测， 对于PMMoV和炭 疽菌有效防治具有重要意 义。 权利要求书2页 说明书20页 附图10页 CN 114959116 A 2022.08.30 CN 114959116 A 1.一种检测辣椒轻斑驳病毒 （PMMoV） 和炭疽菌的RT ‑RAA检测引物组， 其特征在于， 所述 引物组包括辣椒轻斑驳病毒检测引物、 炭疽菌检测引物、 辣椒轻斑驳病毒检测探针P M‑P3和 炭疽菌检测探针CT ‑P1； 其中， 所述辣椒轻斑驳病毒检测引物包括 正向引物PM ‑F2和反向引物PM ‑R2， 正向引物PM ‑F2的序列为5 ´ ‑  CTGTGTACT TCGGCGTTAGGCAATCAG‑3´， 反向引物PM ‑R2的序列为5 ´ ‑  CATTCATGAGGTTACTTATACTGGCCC  ‑3´； 所述炭疽菌检测引物包括 正向引物CT ‑F1和反向引物CT ‑R1， 正向引物CT ‑F1的序列为:  5´ ‑GTGAGATC CGTCGCTAC CAGAAG‑3´， 反向引物CT ‑R1的序列为:5 ´ ‑GCATAGGTTGGTGTCCTCAAAGAG‑3´。 2.如权利 要求1所述的引物组， 其特在于， 所述辣椒轻斑驳病毒检测探针PM ‑P3， 其序列 为5´ ‑ GCACTTCTCGGAGCCTTTGATA CTAGGHACAGGATAATAGAAGTT ‑3´； 所述炭疽菌检测检测探针 CT‑P1， 其序列为5 ´ ‑CTTCAAGTCCGATCTCCGCTTCCAGTCHTCCGCCATCGGTGCCCTTC‑3´； 所述PMMoV的反向引物PM ‑R2的5´端修饰有FITC， 所述检测探针PM ‑P3的5´端修饰有生 物素， PM‑P3的3´端磷酸化修饰， H为四氢呋喃； 所述炭疽菌反向引物CT ‑R1的5´端修饰有地 高辛， 所述探针引物CT ‑P1的5´端修饰有罗丹明， CT ‑P1的3´端有磷酸化修饰， H为四氢呋喃。 3.一种检测辣椒轻斑驳病毒 （PMMoV） 和炭疽菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 权利要求1或2所述的引物组。 4.如权利 要求1或2所述的引物组在用于检测待测生物样本中PMMoV和/或炭疽菌， 或用 于制备检测待测生物样本中是否含有PM MoV和/或炭疽菌的试剂盒中的应用。 5.如权利要求3所述的试剂盒在用于检测待测生物样本中是否含有PMMoV和/或炭疽菌 中的应用。 6.一种利用试剂盒检测PM MoV和/或炭疽菌的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1） 提取待测生物样本的总RNA， 或对植物样本进行裂解处 理； 2） 以步骤1） 提取的总RNA或植物裂解液为模板， 采用权利要求1或2所述的引物组中的 正向引物和反向引物进行RT ‑RAA扩增， 获得扩增产物； 3） 检测扩增产物， 基于扩增产物的检测结果判断是否含有PM MoV和/或炭疽菌 。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 若扩增产物中含有316bp的DNA片段， 则待 测生物样 本中含有PMMoV， 若扩增产物中不含有316b p的DNA片段， 则待测生物样 本中不含有 PMMoV； 若扩增产物 中含有243bp的DNA片段， 则待测生物样本中含有炭疽菌， 若扩增产物 中 不含有243bp的DNA片段， 则待测生物样本中不含有 炭疽菌。 8.一种检测待测生物样本中是否含有PM MoV和/或炭疽菌的方法， 其特 征在于， 包括： 检测待测生物样本的裂解液或总RNA扩增产物中是否含有特异DNA片段， 若含有特异 DNA片段， 则待测生物样 本含有PMMoV和/或炭疽菌， 若不含有特异DNA片段， 则待测生物样 本 不含有PMMoV和/或炭疽菌； 其中， 所述特异DNA片段为权利要求 1或2所述的正向引物和反向 引物的靶序列。 9.一种基于RT ‑RAA‑侧流层析技术检测 PMMoV和/或炭疽菌的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 1） 对样本进行裂解处 理， 或提取待测生物样本的总RNA；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959116 A 22） 以步骤1） 获得的样本裂解液或提取的总RNA为模板， 采用权利要求1或2所述的引物 组进行RT ‑RAA扩增； 3） 应用侧流层析试纸条 进行扩增产物的检测， 若试纸条只在质控区出现一条条带， 检 测区没有条带， 则结果为阴性， 表明样 本中不含有PMMoV和炭疽菌； 若试纸条出现两条条带， 一条位于质控区， 一条位于检测线T1或检测线T2， 则结果为阳性， 表 示样本中含有炭疽菌或 PMMoV； 若试纸条出现三条条带， 一条位于质控 区， 一条位于检测区T1， 一条位于检测区T2， 则结果为阳性， 表明样 本中含有P MMoV和炭疽菌； 若试纸条质控线不显 色， 则检测无效， 需要 更换试纸条重新检测。 10.一种检测辣椒轻斑驳病毒 （PMMoV） 和炭疽菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包 括包括权利要求1或2所述的引物组， 侧流层析试纸条， 所述侧流层析试纸条上检测线T1和 检测线T2、 质控区， 所述侧流层析 试纸条能够对引物组的扩增产物进行检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959116 A 3