(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210625123.9 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南 开区卫津路94 号 申请人 中国南水 北调集团中线 有限公司天 津分公司 (72)发明人 王孟尧　刘信勇　屈亮　冯剑丰　 朱琳　 (74)专利代理 机构 四川省方圆智云知识产权代 理事务所(普通 合伙) 51368 专利代理师 严晓玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测输水系统中淡水壳菜 含量的方法 (57)摘要 本发明中公开了一种检测输水系统中淡水 壳菜含量的方法， 使用实时荧光定量PCR技术对 输水系统中淡水壳菜的DNA绝对含量进行检测， 用于扩增所述淡 水壳菜DNA的引物序列如SEQ  ID  NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 本发明使用实时荧光 定量PCR法对水体中淡水壳菜DNA含量进行绝对 定量的检测， 该检测方法简单易操作， 灵敏度稿， 快速且有效， 成本低廉， 可广泛应用于水体中入 侵物种淡水壳菜成分的量 化鉴定。 权利要求书1页 说明书3页 序列表3页 附图4页 CN 114875159 A 2022.08.09 CN 114875159 A 1.一种检测输水系统中淡水壳菜含量的方法， 其特征在于， 使用实时荧光定量PCR技术 对输水系统中淡水壳菜的DNA 绝对含量进行检测， 用于扩增所述淡水壳菜DNA的引物序列如 SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 以淡水壳菜DNA为模板进行PCR扩增， 以序列SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2为扩增引 物； PCR扩增产物连接pMD18 ‑TVector获得重组质粒； S2、 测定S1中重组质粒OD260 的值， 通过公式换算成拷贝数； 并对S1中的重组质粒进行 10倍梯度稀释得到重组质粒稀释液， 选择重组质粒的10‑2～10‑7倍稀释液作为标准品用于 制备标准曲线； S3、 以序列SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2为扩增引物， 使用SYBR荧光定量PCR法检测标准 品中淡水壳菜DNA的CT值， 制得 标准曲线； S4、 以序列SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2为扩增引物， 使用SYBR荧光定量PCR法检测待测 样本中淡水壳菜DNA的CT值， 将待测样本中淡水壳菜DNA的CT值带入S3制得的标准曲线中， 计算获得待测样本中淡水壳菜的DNA绝对 含量。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述S1中获得的重组质粒的长度为 2937bp， 所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述S4中待测样本来源于地下输水系统管 道中的水体。 5.根据权利 要求2所述的方法， 其特征在于， 所述S1中PCR扩增的反应程序为： 95℃保持 3min之后， 95℃变性3 0s、 56℃退火3 0s、 72℃延伸40s， 持续3 5个循环。 6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述S3和S4中PCR反应程序为： 95℃保持 5min之后， 95℃变性3 0s、 56℃退火3 0s、 72℃延伸40s， 持续 40个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875159 A 2一种检测输水系统中淡 水壳菜含量的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 尤其涉及一种检测输水系统中淡水壳菜 含量的方法。 背景技术 [0002]淡水壳菜又名沼蛤， 生物学上隶属于软体动 物、 双壳类和贻贝科。 侧面像一个三角 形； 腹面较平坦， 隆起的一面是背部； 腹面有两个开口， 有咬合齿和足丝， 表面主要由浅绿 色、 棕色等混合而成， 一般随着年龄的增长， 外壳颜色较深。 主要以浮游藻类， 有机物和微生 物为食， 喜食浮游藻类(蓝藻和绿藻)的滤食性生物， 幼虫约100 ‑500um， 成虫约8 ‑30mm。 高约 10mm,外壳薄， 但较硬。 淡水壳菜在幼虫变态后具有丰富的足丝， 以此固着水下砖石， 船舶、 码头的木桩、 堤坝、 管道上等， 易 堆积成块 生活， 且易 生活在较干净的水质中。 [0003]淡水壳菜易随水流进入输水管道系统中， 其存在对长距离地下箱涵输水系统是一 种巨大的隐患， 淡水壳菜分泌的足丝易产生酸液具有较强的腐蚀作用； 较强的附着能力促 使其很难移动， 较低的水速使其易在管道拐角处形成堆积 状态， 减少管道过流面积， 堵塞 管 道， 增大管道输水能耗。 并且极大的影响了水质， 对人类的身体健康造成了隐患。 但是地下 输水系统取水 口处无法进行排空以致无法对淡水壳菜进行密度和大小进行定量， 所以， 建 立一套快速解析箱涵关键物种淡水壳菜 含量的检测方法是十分必要的。 发明内容 [0004]本发明的目的在于解决现有技术中存在的不能快速有效地检测地下输水系统管 道中淡水壳菜 含量的问题， 提供一种检测输水系统中淡水壳菜 含量的方法。 [0005]为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下： 一种检测输水系统中淡水壳 菜含量的方法， 使用实时荧光定量PCR技术对输水系统中淡水壳菜的DNA绝对含量进行检 测， 用于扩增所述淡水壳菜DNA的引物序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 [0006]优选地， 包括以下步骤： [0007]S1、 以淡水壳菜DNA为模板进行PCR扩增， 以序列SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2为扩 增引物； PCR扩增产物连接pMD18 ‑TVector获得重组质粒； [0008]S2、 测定S1中重组质粒OD260的值， 通过公式换算成拷贝数； 并对S1中的重组质粒 进行10倍梯度稀释得到重组质粒稀释液， 选择重组质粒的10‑2～10‑7倍稀释液作为标准品 用于制备 标准曲线； [0009]S3、 以序列S EQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物， 使用S YBR荧光定量P CR法检测 标准品中淡水壳菜DNA的CT值， 制得 标准曲线； [0010]S4、 以序列S EQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为扩增引物， 使用S YBR荧光定量P CR法检测 待测样本中淡水壳菜DNA的CT值， 将待测样 本中淡水壳菜DNA的CT值带入S3制得的标准曲线 中， 计算获得待测样本中淡水壳菜的DNA绝对 含量。 [0011]优选地， 所述S1中获得的重组质粒的长度为2937bp， 所述重组质粒的核苷酸序列 如SEQ ID NO.3所示。说　明　书 1/3 页 3 CN 114875159 A 3