(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211245113.9 (22)申请日 2022.10.12 (71)申请人 福州海关技 术中心 地址 350010 福建省福州市 鼓楼区温泉街 道湖东路312号 (72)发明人 黄嫦娇　张体银　郑晖　郑腾　 何永强　田国宁　张志灯　王武军　 于师宇　 (74)专利代理 机构 北京卓胜佰达知识产权代理 有限公司 16 026 专利代理师 刘冬梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物组合和探针 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测蜜蜂亮热厉螨的引 物探针组合物及其检测方法， 涉及动物卫生技术 领域。 具体地公开了用于检测蜜蜂亮 热厉螨的引 物对， 所述引物对为特异性扩增COI基因或含有 所述COI基因片段的一对引物， 所述COI基因的核 苷酸序列为SEQ  ID No.1。 本发明利用收集的多 株亮热厉螨进行DNA扩增和序列分析比对， 筛选 核酸保守序列作为靶目标， 开发了用于检测蜜蜂 亮热厉螨的引物探针组合物及实时荧光PCR检测 方法。 本发 明的引物探针组合物及其检测方法灵 敏度高， 最低检测限为2.8拷贝/μL， 并且特异性 好， 与其他蜂螨均无交叉反应， 可用于蜜蜂亮热 厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别， 以及进出口 蜜蜂及蜂产品的检疫。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 115537470 A 2022.12.30 CN 115537470 A 1.一种用于检测蜜蜂亮热厉螨的引物对， 其特征在于， 所述引物对为特异性扩增COI基 因或含有所述COI基因片段的一对引物， 所述COI基因的核苷酸序列为SEQ  ID No.1。 2.根据权利要求1所述的引物对， 其特征在于， 所述引物对由引物TCL_F和引物TCL_R组 成， 所述引物TCL_F为SEQ  ID No.2所示的单链DNA分子； 所述引物TCL_R为SEQ  ID No.3所示 的单链DNA分子 。 3.一种用于检测蜜蜂亮热厉螨 的组合物， 其特征在于， 所述组合物由权利要求1或2所 述的引物对和蜜蜂亮热厉螨特异性探针组成， 所述蜜蜂亮热厉螨特异性探针为与所述COI 基因特异结合的单链DNA分子 。 4.根据权利要求3所述的组合物， 其特 征在于， 所述探针的核苷酸序列为SEQ  ID No.4。 5.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记荧光基团， 3 ’端标 记淬灭基团。 6.根据权利 要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记FAM， 3 ’端标记BHQ ‑ 1。 7.一种用于检测蜜蜂亮热厉螨的试剂或试剂盒， 其特征在于， 所述试剂或试剂盒包含 权利要求1所述的引物对或权利要求3 ‑6中任一所述的组合物。 8.权利要求1所述的引物对或权利要求3 ‑6中任一所述组合物的下述任一种应用： A1)在检测蜜蜂亮热厉螨或制备用于检测蜜蜂亮热厉螨的产品中的应用； A2)在检测COI基因或制备用于检测COI基因的产品中的应用； A3)在鉴定或辅助鉴定蜜蜂亮热厉螨中的应用； A4)在制备用于鉴定或辅助鉴定蜜蜂亮热厉螨的产品中的应用； A5)在鉴别区分蜜蜂亮热厉螨和其他蜂螨或制备用于鉴别区分蜜蜂亮热厉螨和其他蜂 螨的产品中的应用； A6)在蜜蜂亮热厉螨防控中的应用。 9.一种的检测蜜蜂亮热厉螨的方法， 其特征在于， 所述方法包括使用权利要求1所述引 物对或权利要求3 ‑6中任一所述组合物对待测样 品进行PCR扩增反应， 根据PCR扩增产物确 定待测样品是否含有 蜜蜂亮热厉螨或待测样品是否为蜜蜂亮热厉螨。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述根据PCR扩增产物确定待测样品是否 含有蜜蜂亮热厉螨或待测样品是否为蜜蜂亮热厉螨的方法为下述任一种： B1)根据PCR扩增产物中是否含有一个大小为134bp的DNA片段， 确定待测样品是否含有 蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨： 如果PCR扩增产物 中含有一个大小为134bp的DNA片 段， 所述待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮 热厉螨； 如果P CR扩增产 物中不含有一个 大小为134bp的DNA片段， 所述待测样品中不含有 蜜蜂亮热厉螨或不 为蜜蜂亮热厉螨； B2)根据PCR扩增产物的扩增曲线和/或溶解曲线确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨 或是否为蜜蜂亮热厉螨： 如果扩增曲线为S型曲线确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为 蜜蜂亮热厉螨； 如果扩增曲线不为S型曲线， 确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜 蜂亮热厉螨； 如果溶解曲线为单峰型曲线确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热 厉螨； 如果溶解曲线不为单峰型曲线或无峰， 确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为 蜜蜂亮热厉螨； B3)根据PCR扩增产物的Ct值确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115537470 A 2厉螨： 如果Ct值≤35确 定待测样 品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨； 如果Ct值>35， 确定待测样品中不含有 蜜蜂亮热厉螨或不 为蜜蜂亮热厉螨。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115537470 A 3