(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210830476.2 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 中国人民解 放军南部战区总医院 地址 510010 广东省广州市越秀区流 花路 111号 (72)发明人 李林海　邝振展　陈建芸　孙朝晖　 肖斌　陈丽莎　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的试剂 盒 (57)摘要 本 发 明 提 供 一 种检 测 肿瘤驱 动基因 TP53R248W的试剂盒， 用核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 5所示的crRNA， 将R248W突变碱基设计在 crRNA的间隔序列的5 ’末端， 并引入新的错配碱 基C， 当crRNA的间隔序列与野生型RNA之间有两 个碱基错配， 将不会形成复合物， 不能激活 Cas13a蛋白。 本发明的试剂盒最低可以检测出突 变频率为0.01％的混合质粒， 最低能检测出血浆 中浓度为104copies/μL的TP53R248W变异体。 本 发明的试剂盒， 具有良好的灵敏度， 特异性高， 操 作简便， 快速高效。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 115261470 A 2022.11.01 CN 115261470 A 1.一种组合物， 其特征在于， 所述组合物包括crRNA、 引 物和探针， 所述crRNA的核苷酸 序列如SEQ  ID NO： 5所示。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述引 物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2 和SEQ ID NO： 4所示。 3.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6 所示。 4.根据权利 要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记FAM基团， 3 ’端标记 BHQ1基团。 5.权利要求1～4任一所述组合物在制备检测肿瘤驱动基因TP5 3 R248W产品中的应用。 6.一种检测肿瘤驱动基因TP53  R248W的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中含有权利 要求1～4任一所述组合物。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中含有RAA或PCR扩增试剂， 以及CRIPSR/Cas13a检测试剂， 所述RAA或PCR扩增试剂含有权利要求2中所述引物， 所述 CRIPSR/Cas13a检测试剂含有权利要求1中所述crRNA和权利要求3中所述探针。 8.根据权利 要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中RAA扩增试剂还包括RAA反 应液、 MgCl2、 水和RAA干粉， 所述RA A干粉含有重组酶、 单链结合蛋白和DNA聚合酶。 9.根据权利 要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中PCR扩增试剂还包括DNA聚 合酶和水。 10.根据权利 要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中CRIPSR/Cas13a检测试剂 还包括权利要求8或9中所述扩增试剂的扩增产物、 权利要求1 中所述crRNA、 Cas13a蛋白、 权 利要求3中所述探针、 T7转录酶、 RNA酶抑制剂、 5 ×的T7 buffer、 NTP和水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261470 A 2一种检测肿瘤 驱动基因TP53  R248W的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及 基因检测技术领域， 具体地， 涉及一种检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的 试剂盒。 背景技术 [0002]TP53是非常重要的抑癌基因， 在正常细胞中低 表达， 在恶性肿瘤中高表达。 该基因 的错义突变、 插入或缺失造成的失活突变非常常见。 临床研 究证实肿 瘤中95.1％的TP53点 突变主要发生在高度保守的175、 245、 248、 249、 273和282位点。 TP53中的功能丧失事件在癌 症中很常见， R248W变异体不仅导致肿 瘤抑制的丧失， 而且作为一种功能获得突变， 可促进 小鼠模型中的肿瘤发生。 与野生型突变株相比， 这种突变株对阿霉素治疗反应更灵敏。 现已 证明R248W突变会导致更差的生存率。 对肿瘤驱动基因TP53  R248W的检测有助于临床上的 用药指导和预后评估， 对提高患者的总生存率具有重要意 义。 [0003]目前， 组织和血浆中的TP53  R248W的检测手段主要有数字PCR， 高通量测序， 突变 扩增系统等。 TP53基因R248W突变是基因742位碱基由C突变为T， 由于只有单个碱基突变， 如 果使用qP CR技术检测会 出现假阳性现象， 这是 因为qPCR所用探针存在固有缺点——容易与 非靶目的基因非特异 性结合， 形成错配， 特别是非靶基因与靶基因只存在一个碱基的差别。 数字PCR技术成本高， 对仪器和操作人员要求高； 高通量测序灵敏度高但实验流程复杂； 突 变扩增系统操作简单但稳定性欠佳， 所以亟需找寻一个新的灵敏度高、 稳定性好及成本低 的肿瘤驱动基因检测方法。 [0004]随着基因检测技术的不断发展， 市场上出现了许多的基因检测项 目， 一大批新兴 企业开始在这个领域争奇斗艳， 如国外的Ancestry、 Illumina、 Helix、 23 an dMe， 和国内的 华大基因、 圣湘 生物、 安我基因等等。 目前国民生活质量正在提高， 消费者的健康意识也逐 渐增强， 越来越多的人开始关注自身的身体健康以及营养情况等深层次需求， 特别是作为 消费主体的年经人， 对于新鲜事物更易接受， 对基因遗传等医学知识更加了解， 乐于使用基 因检测的手段了解自身遗传和身体健康信息， 使得消费级基因检测市场不断增大。 在未来 的商业发展中， 随着基因检测产业越来越成熟， 下游的服务业务将迎来极大的扩展， 基因检 测企业所面临的竞争也将更加激烈， 考验更加巨大。 发明内容 [0005]本发明的目的是克服现有技术的上述不足， 提供一种检测肿瘤驱动基因TP53   R248W的试剂盒。 [0006]本发明的第一个目的是提供一种组合物。 [0007]本发明的第二个目的是提供所述组合物在制备检测肿瘤驱动基因TP53 R248W产品 中的应用。 [0008]本发明的第三个目的是提供一种检测肿瘤驱动基因TP5 3 R248W的试剂盒。 [0009]为了实现上述目的， 本发明是通过以下 方案予以实现的：说　明　书 1/7 页 3 CN 115261470 A 3