(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210626594.1 (22)申请日 2022.06.04 (71)申请人 中国人民解 放军总医院第五医学中 心 地址 100039 北京市丰台区西四环中路10 0 号 (72)发明人 刘毅　马春辉　胡海旭　张丽娟　 刘天懿　 (74)专利代理 机构 北京玄法律师事务所 16 002 专利代理师 潘满根 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测细胞角蛋白CK 19的数字PCR试剂盒 及其应用 (57)摘要 本发明提供一种检测细胞角蛋白CK19的数 字PCR试剂盒及其应用， 所述试剂盒是用于检测 逆转录后的cDNA， 所示试剂盒检测编码为NM_ 002276.5的CDS序列。 本发明提供简单可靠的CTC 数字PCR检测试剂盒， 用于乳腺癌患者的预后判 断和疗效动态评价， 更好的指导个体化治疗的开 展。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 115011693 A 2022.09.06 CN 115011693 A 1.一种检测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒是用于检测逆 转录后的cDNA， 所示试剂盒检测编码为NM_002276.5的CDS序列， 其中所述上游引物起始位 置为443， 终止位置为462； 所述下游引物起始位置为533， 终止位置为514； 和所述探针起始 位置为472， 终止位置为 497。 2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述上游引物的序列为SEQ  ID  No .7 ： AGCCACTACTACACGACCAT ； 所述下游引物的序列为SEQ  ID No .8 ： C A T T G T C G A T C T G C A G G A C A ；和 所 述 探 针 的 序 列 为 S E Q  I D N o .9 ： GCGGGACAAGATTCTTGGTGCCACCA。 3.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， cDNA模板输入量为1 ‑50ng， 优选 为10ng。 4.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述引物终浓度范围为0.67 ‑ 1.5 μM， 优选地定为0.83 μM 。 5.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒， 其特征在于， 所述探针终浓度范围为0.17 ‑ 0.67 μM， 优选地定为0.5 μM 。 6.根据权利 要求1‑5任一所述的数字PCR试剂盒在检测检测细胞角蛋白CK19中的应用， 其扩增条件为： 95℃10分钟， 之后持续 40个循环的如下步骤， 94℃3 0秒， 60℃60秒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011693 A 2一种检测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测领域， 特别涉及一种检测细胞角蛋白CK19的数字PCR试剂盒 及其应用。 背景技术 [0002]恶性肿瘤是导致我国居民死亡的主要疾病类型， 而90％以上的恶性肿瘤死亡都是 由远处转移造成的。 肿瘤的远处转移大致可以分为四个阶段： 突破血管屏障进入 血液循环； 在血液循环系统中存活； 突破血管屏障进入特定的组织部位； 增殖并最终形成转移灶。 其 中， 突破血管屏障之后在血液循环系统中存活的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞 (Circulating  Tumor Cells, CTCs)。 作为恶性肿瘤远处转移的关键环节， CTC在患 者血液 中出现与否及其数量多少， 一方面代表了原发肿瘤浸润进入血管 的能力， 另一方面代表了 在远端器官 形成转移灶的可能性。 [0003]外周血中的CTC数量非常稀少， 大约106‑7个白细胞中才会有1个CTC。 因此， CTC检测 首先需要根据其生物学或物理学特性进行富集， 然后再根据CTC的基因表达或功能特点对 富集到的细胞进行鉴定。 在目前所采用的技术中， 检测上皮特异基因(如细胞角蛋白CK19) 的表达是最常用的表型鉴定手段， 主要的实现形式有抗原和抗体的特异 性结合和RT ‑PCR技 术这两种。 以下对两种技 术分别做介绍。 [0004]采用抗原和抗体特异性结合的技术采用荧光标记的上皮特异抗体  (CK19)检测 CTC中的上皮特异抗原的表达。 同时采用白细胞特异的  CD45抗体与白细胞相结合， 作为一 个排除标准， 此外还采用细胞核染料  DAPI进行染色， 以确认存在细胞核， 避免非细胞颗粒 的干扰。 经过孵育和清洗之后在荧光显微镜下观察荧光的表达情况， CK19阳性， DAPI阳性，   CD45阴性， 且符合细胞形态的事件被定义为CTC。 该方法 的优势是可以直接看到细胞， 方便 在细胞上面做进一步的其他检测。 该方法的不足是图像扫描需要较高水平的显微镜， 成本 较高， 判读起来比较费时费力， 而且容易受到主观因素以及抗体浓度、 抗体批号以及荧光曝 光时间的影响， 导 致不同批次和不同实验室之间检测结果的不 一致性。 [0005]第二种技术是通过RT ‑PCR检测上皮特异的mRNA来进行表 型鉴定， 最常用的基因就 是细胞角蛋白CK19， 根据不同的癌种可以在增加相应组织来源的基因， 比如乳腺癌可以添 加乳腺珠蛋白基因(Mammaglobin， MG)， 肺癌可以添加甲状腺转录因子1(Thyroid   Transcription  Factor‑1， TTF1)等。 为了确保核酸提取的质量， 一般还需要加入内参基因， 常用的包括GAPDH  和ABL1等。 这种方法的优势是： ①充分利用了PCR的超高敏感性和特异 性， 只要有特异的mRNA标志物， 就足以在超过106个白细胞中检测到1  个肿瘤细胞。 因此， 该 方法对前期富集步骤的依赖度并不高， 可以直接对外周血有核细胞提取的RNA进 行检测， 这 样可以避免富集过程中的CTC  损耗；②通过使用多重PCR可以在同一个样 品中评价多个靶 点， 这使得在珍贵并且通常很有限的CTC样品中进行多参数的处理成为可能； ③成本较低， 有成熟的质控体系， 可以进 行自动化处理； ④检测结果相对客观， 不会受到人为影响因素的 干扰等等。 尽管有上述优势并且在一段时间之内获得了广泛的关注， 但是普通的荧光定量说　明　书 1/7 页 3 CN 115011693 A 3