(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210651053.4 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 广州动物园 地址 510075 广东省广州市先烈中路120号 (72)发明人 翟俊琼　陈武　单芬　沈永义　 周妞　李婉萍　 (74)专利代理 机构 广州新诺专利商标事务所有 限公司 4 4100 专利代理师 周端仪 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、 试剂 盒和应用 (57)摘要 本发明提供一种检测穿山甲β冠状病毒的 引物组、 试剂盒和应用， 涉及动物病毒检测技术 领域。 本发 明的检测穿山甲β冠状病毒的引物组 包括外引物和内引物， 各引物的序列如SEQID   No.1～SEQ  ID No.4下所示。 本发明的环介导等 温扩增试剂、 试剂盒包括上述引物组。 本发明的 检测方法采用上述引物组、 环介导等温扩增试剂 或试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增。 本发 明的产品和检测方法具有特异性高、 灵敏度高、 重复性好等优点。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115044710 A 2022.09.13 CN 115044710 A 1.一种检测穿山甲β 冠状病毒的引物组， 其特征在于， 包括外引物和内引物， 各引物的 序列如下： 上游外引物F3： 5’ ‑CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT‑3’(SEQ ID No.1) 下游外引物B3： 5’ ‑AGGTACCTTCTAAATCTGTGC ‑3’(SEQ ID No.2) 上游内引物FIP： 5’ ‑ACAAGAACCATTAAGGAATGATCCTCCATCAGGTGTTTACCAGT‑3’(SEQ ID No.3) 下游内引物BIP： 5’ ‑AGACTATGACTGTGTCTCT TTTTGCCCGCATGTACTC CTGTTG‑3’(SEQ ID No.4)。 2.根据权利要求1所述的引物组， 其特征在于， 所述引物组还包括环引物， 所述环引物 的序列如下： 环引物LB： 5 ’ ‑TACATGCATCACATG GAACTTC‑3’(SEQ ID No.5)。 3.根据权利要求2所述的引物组， 其特征在于， 所述外引物、 内引物和环引物的摩尔比 为(3～5)： 1： (1～3)。 4.一种检测穿山甲β 冠状病 毒的环介导等温扩增试剂， 其特征在于， 包括权利要求1～3 任一项所述的引物组。 5.一种检测穿山甲β 冠状病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1～3任一项所述的 引物组或权利要求 4所述的环介导 等温扩增试剂。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括荧光目视检测试剂、 10×反应缓冲液、 Bst  DNA聚合酶、 水、 阳性标准品。 7.一种穿山甲β 冠状病 毒的检测方法， 其特征在于， 采用权利要求1～3任一项所述的引 物组， 或权利要求4所述的环介导等温扩增试剂， 或权利要求5～6任一项所述的试剂盒， 对 待测样品进行环介导 等温扩增。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述环介导等温扩增的反应体系为： 10×反应缓冲液2.5 μL， 40 μM  FIP、 40 μM  BIP、 10 μM  F3、 10μM B3、 20μM LB各1μL， 8000U/mL   BstⅡDNA聚合酶1 μL， HNB  21 μL， 100 mM MgSO4 2.5 μL， 10 mM dNTP 3.5 μL， 10 mM甜菜碱2 μL， 待 检样品cDNA模板1 μL， 其 余用水补足至25 μL。 9.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述环介导等温扩增的反应条件为： 在61～69℃下恒温水浴5 5～65min， 再置于75～85℃下使酶失活。 10.根据权利要求9所述的检测方法， 其特征在于， 所述环介导等温扩增的反应条件为： 再65℃下恒温水浴6 0min， 再置于80℃下5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044710 A 2一种检测穿山 甲β冠状病毒 的引物组、 试剂盒和应用 技术领域 [0001]本发明涉及动物病毒检测技术领域， 特别是涉及一种检测穿山甲β 冠状病毒的引 物组、 试剂盒和应用。 背景技术 [0002]冠状病毒是一种具有囊膜的单股正链非节段的RNA病毒。 根据国际病毒分类委员 会当前的命名法则， 冠状病毒科分为4个属， 即Alpha、 Beta、 Gamma和Delta冠状病毒属， 其中 Alpha， Beta， Gamma冠状病毒属分别分别对应于以前的1、 2和3群。 同时， Beta冠状病毒属在 进化上又可进一步分为A、 B、 C和D四个不同的群(或谱系)。 [0003]穿山甲是穴居动 物， 免疫系统较特殊， 易感染多种病原微生物， 其所居住或觅食的 洞穴不仅有穿山甲活动， 也可能有蝙蝠、 豪猪、 黄腹鼬、 果子狸、 竹鼠、 蛇等动物的活动， 因此 穿山甲有可能感染或传播多种病原微生物， 从而成为疫病的中间宿主， 甚至是某些具有重 大公共卫生风险的病原 微生物携带者。 现有的研究表明， 穿山甲可以感染BETA冠状病毒， 且 谱系复杂， 不仅有B谱系， 还有A谱系。 其中B谱系 与人SARS ‑Cov‑2具有一定的相关性， 对于研 究SARS‑Cov‑2的溯源、 进化、 变异与跨物种传播等研究具有极其重要的价值。 而通过对穿山 甲冠状病毒的报道分析， 推断穿山甲的携带的BETA冠状病毒种类更多， 传播地区比目前所 检测到地区更广， 因此需要更快速、 更简便的方法进行更多地区和更多穿山甲及相关物种 的检测。 [0004]环介导等温扩增(loop ‑mediated  isothermal  amplification,LAMP)是Notomi等 人发展起来的技术。 LAMP具有较高的特异性和灵敏度， 操作简单， 不需要专门的设备。 LAMP 是用具有链置换活性的BstDNA聚合酶(即来自嗜热脂肪芽胞杆菌的修饰DNA聚合酶)进行 的。 温度从61℃到69℃， 在等 温条件下在30‑60min内完成检测。 最终的扩增产物是带有不同 茎的茎环DNA的混合物， 可以通过直接观察 或通过琼脂糖凝胶 进行分析。 LAMP方法已被开发 用于检测多种病毒， 包括口蹄疫病毒、 登革热病毒、 风疹病毒和西尼罗河病毒， 但尚未应用 于检测穿 山甲源BETA冠状病毒(Pan ‑β‑Cov)。 发明内容 [0005]基于此， 有必要针对上述问题， 提供一种检测穿山甲β 冠状病毒的引物组， 具有特 异性强、 灵敏度高、 重复性 好等优点。 [0006]本发明提供的检测穿山甲β 冠状病毒的引物组， 包括外引物和内引物， 各引物的序 列如下： [0007]上游外引物F3： [0008]5’ ‑CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT‑3’(SEQ ID No.1) [0009]下游外引物B3： [0010]5’ ‑AGGTACCTTCTAAATCTGTGC ‑3’(SEQ ID No.2) [0011]上游内引物FIP：说　明　书 1/6 页 3 CN 115044710 A 3