(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210936071.7 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 武汉珈创生物技 术股份有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速器3.1期4栋1层、 2层、 3层 (72)发明人 张若璇　袁冰　徐国东　罗祥　 陈连栋　 (74)专利代理 机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 专利代理师 吴慧珺 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合 物、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 具体提供 了一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合 物， 包括反转录引物SRV ‑RT.RP， 检测猴D型逆转 录病毒4型的上游引物P ‑SRV4‑F、 下游引物P ‑ SRV4‑R和探针SRV4 ‑P， 检测猴D型逆 转录病毒5型 的上游引物P ‑SRV5‑F、 下游引物P ‑SRV5‑R和探针 SRV5‑P， 检测猴D型逆 转录病毒8型的上游引物P ‑ SRV8‑F、 下游引物P ‑SRV8‑R和探针SRV8 ‑P。 本发 明还提供了包括该引物探针组合物的试剂盒及 采用该引物探针组合物同时检测多血清型猴D型 逆转录病毒的方法， 特异性强、 灵敏度高， 极大的 缩短了检测时间， 为采取有针对性的综合防控措 施提供参考数据， 利于实验猴病原体SRV的快速 检测和流行病学的调查与预防。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115323076 A 2022.11.11 CN 115323076 A 1.一种检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物， 包括反转录引物SRV ‑RT.RP， 检测猴D 型逆转录病毒4型的上游引物P ‑SRV4‑F、 下游引物P ‑SRV4‑R和探针SRV4 ‑P， 检测猴D型逆转 录病毒5型的上游引物P ‑SRV5‑F、 下游引物P ‑SRV5‑R和探针SRV5 ‑P， 检测猴D型逆转录病毒8 型的上游引物P ‑SRV8‑F、 下游引物P ‑SRV8‑R和探针SRV8 ‑P， 其特征在于： 所述SRV‑RT.RP的序列为 5’ ‑CTTCCTGGTGTGGCTCTAAT‑3’ 5’ ‑CTTCCTGGTGTGGCTCTAGC ‑3’； 所述P‑SRV4‑F的序列为5 ’ ‑TGCCTCACACCCCTCGC‑3’； 所述P‑SRV4‑R的序列为5 ’ ‑CCTGACCTTGTCCATCTAC‑3’； 所述SRV4 ‑P的序列为5 ’ ‑CACAGCACT TCCCTCTTG‑3’； 所述P‑SRV5‑F的序列为5 ’ ‑TGACCCTGACGATGACGAC ‑3’； 所述P‑SRV5‑F的序列为5 ’ ‑TTGTAAGGAGGTGGACGAGTT‑3’； 所述SRV5 ‑P的序列为5 ’ ‑TATCTGGCTGCCGCATCCG‑3’； 所述P‑SRV8‑F的序列为5 ’ ‑CTGCTATTCGCCCTTAC‑3’； 所述P‑SRV8‑F的序列为5 ’ ‑CACCCTCCTTTATCCTTATT‑3’； 所述SRV8 ‑P的序列为5 ’ ‑TATCCGCCTTTGTTCG‑3’。 2.一种检测猴D型逆转录病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括如权利要求1所 述的引物探针组合物。 3.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述引物探针组 合物中所述SRV ‑RT.RP、 所述P ‑SRV4‑F、 所述P‑SRV4‑R、 所述SRV4 ‑P、 所述P‑SRV5‑F、 所述P‑ SRV5‑R、 所述SRV5 ‑P、 所述P‑SRV8‑F、 所述P‑SRV8‑R和所述SRV8 ‑P的终浓度均为0.1mM ‑1mM。 4.如权利 要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述SRV4 ‑P、 所述 SRV5‑P和所述SRV8 ‑P在5’端标记的荧光基团为FAM、 VIC、 HEX、 CY5、 Texas  Red中的任一种， 且各探针在5 ’端标记的荧光基团互不相同； 所述SRV4 ‑P、 所述SRV5 ‑P和是SRV8 ‑P在3’端标 记的荧光基团为BHQ1和BHQ2中的任一种。 5.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒， 其特征在于： 还包括定量标准 品1‑7； 所述定量标准品1为1.0 ×101copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×101copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×101copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物； 所述定量标准品2为1.0 ×102copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×102copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×102copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物； 所述定量标准品3为1.0 ×103copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×103copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×103copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物； 所述定量标准品4为1.0 ×104copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×104copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×104copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物； 所述定量标准品5为1.0 ×105copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×105copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×105copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物； 所述定量标准品6为1.0 ×106copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×106copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×106copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115323076 A 2所述定量标准品7为1.0 ×107copies/μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×107copies/μl的PUC57 ‑ SRV5和1.0 ×107copies/ μl的PUC 57‑SRV8混合物。 6.如权利要求5所述的检测猴D型逆转录病毒的试剂盒， 其特 征在于： 所述PUC57 ‑SRV4标准品保守区基因序列为TGCCTCACACCCCTCGCTGGCCAGGTCAACATGTCC CAAGAGGGAAGTGCTGTGCCA GTCGAGAAAAAGAA GAGTTACCCCCTAAA GACATTTTCCCA GTAACAGAAACTGT AGATGGACAAGGTCAGG； 所述PUC57 ‑SRV5标准品保守区基因序列为： TGACCCTGACGATGACGACCCCGACCCGCAAGAAG TAAATTGGGACGATCTTGCGGATGCGGCAGCCAGATATCATAACCCTGACTGGCCGCCATTTTTAACTCGTCCACCT CCTTACAA 所述PUC57 ‑SRV8标准品保守区基因序列为GCTGCTATTCGCCCTTACAGAAAGAAAACAGATTTA ACTGGTTATATCCGCCTTTGTTCGGATATTGGACCCTCTTATCAGCAA GGCCTGGCCATGGCCGCCGCGTTCA GCG GACAAACTGTGAAAGATTTCCTAAACAACAAAAATAAGGATAAAGGAGGGTG。 7.如权利要求2所述的检测猴D型逆转录病 毒的试剂盒， 其特征在于： 还包括阳性对照； 所述阳性对照为1.0 ×105copies/ μl的PUC57 ‑SRV4、 1.0 ×105copies/ μl的PUC57 ‑SRV5和1.0 ×105copies/ μl的PUC 57‑SRV8的混合物。 8.一种猴D型逆转录病毒的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待测样本RNA， 并制备cDNA模板； (2)利用如权利要求1所述的检测猴D型逆转录病毒的引物探针组合物对待测样本进行 荧光定量PCR反应； (3)根据荧光定量PCR反应结果， 判断待测 样品中是否含有猴D型逆转录病毒及所含猴D 型逆转录病毒的血清型。 9.如权利要求8所述的猴D型逆转录病 毒的检测方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中荧光 定量PCR反应程序包括： 95℃预变性50min； 扩增41个循环， 每个循环95℃变性15s， 55℃退火 30s， 72℃延伸3 0s。 10.如权利要求8所述的猴D型逆转录病毒的检测方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中判 断方法具体为： 当待测样 品的荧光曲线为 “S”型扩增， 且Ct值≤35时， 则判断该荧光曲线所 对应的猴D型逆转录病毒血清型为阳性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115323076 A 3