(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211294295.9 (22)申请日 2022.10.21 (71)申请人 深圳市绿诗源生物技 术有限公司 地址 518000 广东省深圳市大鹏新区大鹏 办事处布新社区布 新村工业大道2 号D 栋101.201.3 01 (72)发明人 蔡杰　许芳　刘明如　蒋永青　 张吉　朱永利　 (74)专利代理 机构 深圳信科专利代理事务所 (普通合伙) 44500 专利代理师 刘志刚 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/58(2006.01) G01N 33/558(2006.01) G01N 33/543(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 一种检测猪弓形 虫病的引物、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测猪弓形虫病的引物、 试剂盒及方法， 属于猪弓形虫病毒检测技术领 域， 包括盒体， 所述盒体内装有检测板和底板， 所 述检测板的顶部开设有观察窗， 所述观察窗的内 部设有第一检测线， 所述观察窗的内部靠近第一 检测线的一侧设有第二检测线， 所述观察窗的内 部靠近第二检测线的一侧设有质控线， 所述检测 板顶端的一侧开设有加样孔， 所述加样孔内插入 有采样吸管， 本发明提供的一种猪弓形虫病检测 板， 利用免疫层析技术， 对样本实现快速检测， 具 有灵敏度高和耗时短的优点， 同时利用间接免疫 荧光检验的方法来进行辅助检测， 比直接法敏 感 度提高5‑10倍， 且一种荧光二抗可检测多种抗原 抗体系统， 制备方法简单， 成本低廉， 易于进行商 业化生产。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 115521989 A 2022.12.27 CN 115521989 A 1.一种检测猪弓形虫病的引物， 包括猪弓形虫病原体， 其特征在于， 所述提取弓形虫的 cDNA为模板， SAGL ‑F、 SAGL‑R为上下游引物， 对SAGL基因进行PCR扩增； 上游引物： P DCoV‑F： 5’ ‑TCGGATCCCCCTCTTGTTGC‑3’ 下游引物： P DCoV‑F： 5’ ‑AGCCGATTTTGCTGACCCTG‑3’ 所述扩增的猪弓形 虫病毒基因目的片段为3 59bq。 2.一种检测猪弓形虫病的试剂盒， 包括盒体(1)， 其特征在于， 所述盒体(1)内装有检测 板(2)和底板(3)， 所述检测板(2)的顶部开设有观 察窗(4)， 所述观察窗(4)的内部设有第一 检测线(5)， 所述观察窗(4)的内部靠近第一检测 线(5)的一侧设有第二检测线(6)， 所述观 察窗(4)的内部靠近第二检测线(6)的一侧设有质控线(7)， 所述检测板(2)顶端的一侧开设 有加样孔(9)， 所述加样孔(9)内插 入有采样吸管(8)。 3.权利要求2所述的一种检测猪弓形虫病的试剂盒， 其特征在于， 所述底板(3)的顶部 设有硝酸纤维素膜(13)， 所述硝酸纤维素膜(13)顶部的结构和观 察窗(4)内的结构相同， 所 述硝酸纤维素膜(13)的一侧设有吸水纸(11)， 所述硝酸纤维素膜(13)的另一侧设有金标垫 (12)， 所述金 标垫(12)的一侧设有样品垫(10)。 4.权利要求2所述的一种检测猪弓形虫病的试剂 盒， 其特征在于， 所述具体使用步骤如 下： S1、 采用胶体金标记猪弓虫病单克隆抗体， 得到所述胶体金标记的猪弓虫病抗体； 将胶 体金标记的猪弓虫病抗体， 喷涂在金 标垫12上； S2、 将胶体金标记的猪弓虫病抗体包被在硝酸纤维素膜上， 形成第一检测线5； 将羊抗 鼠IgG包被在位于所述第一检测线5另一侧的硝酸纤维素膜13上， 形成质控线 7， 且进行干燥 处理； S3、 在底板3上分别顺次搭接对应的样品垫10、 金标垫12、 硝酸纤维素膜 13和吸水纸11， 组成对应的板后， 切成猪弓虫病检测试纸条； S4、 将制得的猪弓虫病检测试纸条装进塑料盒体1中， 调整猪弓虫病检测试纸条的位 置， 使加样孔9在样品垫10上方， 观 察窗4在第一检测线5、 第二检测线6以及质控线7上方， 即 得猪弓虫病检测板2； S5、 将S4中制备的猪弓虫病检测板2和样本稀释液置于盒体1中， 得到猪弓虫病检测试 剂盒。 5.一种检测猪弓形 虫病的方法， 其特 征在于， 所述所需的仪器设备如下： 低温冰箱、 制冰设备、 水平摇床、 离心机、 振荡器、 灭菌器、 干燥箱、 凝胶成像设备、 核酸 电泳仪、 荧光显微镜 。 6.权利要求5所述的一种检测猪弓形 虫病的方法， 其特 征在于， 所述所需材 料如下： 氨苄青霉素、 DMEM、 彩色预染蛋白Marker、 Trypsin ‑EDTA、 卡那霉素(Kan)、 蛋白酶抑制 剂、 单片段同源重组酶、 DNA  Marker、 PVDF膜、 核酸染料以及无水乙醇、 氯化钠、 氯化钾、 甲 醇。 7.权利要求5所述的一种检测猪弓形虫病的方法， 其特征在于， 所述试剂的配制方法如 下。 S1、 称量2gNaCl， 2gTryptone， 1gYeastExtract， 先用量筒量取150mL， 去离子水， 完全溶 解后定容至200mL， 温度要保证在121℃， 灭菌15min， 称量2gNaCl， 2gTryptone， 1gYeast  权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115521989 A 2Extract， 3 gAgar powder,先用量筒量取150mL去离子水， 完全溶解后定容至200mL， 同样温 度保证121℃， 灭菌15mi n。 灭菌结束后使其降温至 50℃倒板， 将固体板放于4℃冰箱保存； S2、 分别称 取NaCl、 KCl、 Na2HPO4、 KH2PO4置于烧杯中， 量取去离子水900mL， 将称 取得药 品和去离子水混合， 放置于磁力搅拌器， 进行搅拌使 试剂充分溶解， 将pH调至7.4， 然后 将溶 液定容至1L， 倒入洁净的试剂瓶中， 进行高压灭菌后备用， 称量Tris、 Glycine、 SDS三种试 剂， 加入约 800mL的去离子水， 搅拌使试剂完全 溶解， 最后加去离子水将溶液定容至1L， 室温 保存备用， 在4.196mL灭菌后的蒸馏水中加入1 g IPTG搅拌溶解， 用0.22 μm的滤膜除菌， 分装 到2mLEP管中， 终浓度为1M， 且 储存于‑20℃冰箱备用； S3.称量242g  Tris， 37.2g  Na2EDTA.2H20倒入1L体积烧杯中， 完全溶解后,加入57.1mL   HAC定容至1L， 室温保存,称量0.3g琼脂糖粉末倒入锥形瓶中， 加入1mL  50×TAE Buffer， 量 取29mL去离子水加入锥形瓶中， 至于微波炉中加热至胶完全 溶解,放凉至加入5 μL核酸染色 剂， 摇匀后倒入插好梳子的胶托内， 室温凝固30min后使用,称量1g考马斯亮蓝R ‑250倒入 300mL去离子水中， 分别量取100mL冰醋酸， 250mL甘油倒入烧杯中， 完全溶解后， 定容至1L， 利用滤纸过 滤,后室温保存； S4.用量筒量取500mL甲醇倒 入1L体积烧杯中， 加入100mL冰醋酸， 定容至1L， 室温保存， 称量8.8g  NaCl倒入1L体积烧杯中， 量取20mL1M  pH＝8.0的Tris  HCl， 吸取0.5mL  Tween‑ 20， 分别加入烧杯中， 完全溶解后， 定容至1L， 室温保存， 称量0.5g脱脂奶粉倒入15 mL离心管 内， 吸取10mL TBST Buffer于离心管使其溶解， 现用现配， 称量0.22g  NaCl倒入15mL离心管 内， 吸取10μL  PMSF加入离心管内， 先加入8mL  1×PBS使其完全溶解， 定容至10mL， 称量 0.22g NaCl倒入15mL离心管内， 吸取10 μLPMSF加入离心管内， 先加入8mL  1×PBS使其完全 溶解， 定容至10mL， 称量0.61464g谷胱甘肽(还原型)倒入15mL离心管内， 吸取 10 μLPMSF加入 离心管内， 先加入8mL  1×PBS使其完全溶解， 定容至10mL， 现用现配。 S5.用量筒量取22.2mL硫酸溶液倒 入177.8mL体积的去离子水中， 室温保存,称量2.93g   NaHCO3， 1.59g Na2CO3， 溶解在900mL蒸馏水的烧杯中， 完全溶解后， 室温保存,将配好的 0.01M PBS缓冲溶液放于烧杯中， 吸取0.5mL  Tween‑20， 搅拌使试剂完全溶解， 定容至1L， 倒 入干净的广口瓶中， 现配现用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115521989 A 3