(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210755452.5 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 湖南工程学院 地址 411100 湖南省湘潭市福星东路8 8号 (72)发明人 张何　刘琼　高赛男　杨梅　李倩　 傅昕　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 张梦泽 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种检测牛结核分枝 杆菌的试剂、 试剂盒及 检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的 试剂、 试剂盒及检测方法， 属于分子生物学检测 技术领域； 所述试剂包括基于CRISPR/Cas12a正 反馈循环机制的识别元件、 超支化杂交链式反应 信号放大反应用试剂和比色分析用试剂； 本发明 以CRISPR/Cas12a为特异性识别元件， 自催化后 引发超支化杂交链式反应并形成n层分支的DNA 纳米结构， 并在DNA纳米结构上构建多维G ‑四链 体‑血红素DNA酶矩阵， 从而实现多重信号放大， 完成对牛结核分枝杆菌 ‑DNA的超灵 敏检测。 本发 明对牛结核分枝杆菌DNA具有较高的特异性选 择， 检出限为8.9aM(LOD＝3σ/S)， 实现了对牛结 核分枝杆菌DNA的超灵敏检测。 权利要求书2页 说明书11页 序列表4页 附图4页 CN 114921576 A 2022.08.19 CN 114921576 A 1.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂， 包括基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别 元件、 超支化杂交链式反应信号 放大反应用试剂和比色 分析用试剂； 所述基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件包括： gRNA ‑T、 Cas12a蛋白、 辅助 探针和可切换导向RNA； 所述可切换导向RNA由iDNA ‑spacer、 iDNA ‑handle和gRNA组装得到； 所述gRNA ‑T的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述辅助探针为SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示 的核苷酸序列经碱基互补配对组成 的双链； 所述iDNA‑spacer的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述iDNA‑handle的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述gRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 所述超支化杂交链式反应信号放大反应用探针包括H1、 SH1、 H2、 L1、 L2和SH2； 所述H1、 H2、 SH1、 SH2、 L1和L2的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.7～SEQ  ID NO.12所示； 所述比色 分析用试剂包括氯化血红素、 H2O2和ABTS。 2.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 所述iDNA ‑spacer、 iDNA ‑handle和gRNA的 摩尔比为(1.1～1.3)： (1.1～1.3)： 1。 3.一种检测牛 结核分枝杆菌的试剂盒， 包括权利要求1或2所述的试剂。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阳性对照； 所述阳性 对照品包括SEQ  ID NO.23和SEQ  ID NO.24所示的核苷酸序列碱基互补配对组成的目标序 列。 5.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述gRNA ‑T的工作液浓度为50nM； 所述 辅助探针的工作液浓度为500nM； 所述可切换导向RNA的工作液浓度为1 μM； 所述Cas12a蛋白 的工作液浓度为1 μM 。 6.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H1、 SH1、 H2、 L1、 L2或SH2的工作液浓 度分别为1 μM 。 7.一种基于权利要求1或2所述试剂或者权利要求3～6任意一项所述试剂盒的非诊断 目的的牛结核分枝杆菌的检测方法， 包括以下步骤： 1)将待测样本和所述CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件混合， 进行正反馈识 别切割反应， 得到包 含引发序列的第一产物； 2)将所述SH1、 SH2、 H1、 H2分别溶解于缓冲液， 分别进行第一孵育， 分别得到发夹结构的 SH1、 SH2、 H1、 H2； 3)将所述第一产物、 L1、 L2和发夹结构的SH1、 SH2、 H1、 H2混合， 进行超支化杂交链式反 应信号放大反应， 得到第二产物； 4)将所述第二产物和氯化血红素混合， 于黑暗条件下进行第二孵化， 得到第二孵化产 物； 将所述第二孵化产物和H2O2、 ABTS混合， 进行第 三孵化， 得到第三孵化产物； 对所述第三 孵育产物进行固液分离， 收集液体组分； 5)对所述液体组分进行紫外分光检测， 获得在A420nm处的最大吸收峰， 根据标准曲线获 得待测样本中牛 结核分枝杆菌的浓度值； 所述标准 曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量， 以在A420nm处的校正后的最大权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921576 A 2吸收峰为因变量得到的标准曲线； 所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到， ΔA420nm＝A420nm‑A0， 式1； 其中ΔA420nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰； A420nm为实际测得的已知牛结核分支 杆菌DNA靶标浓度的最大吸 收峰， A0为牛结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值； 所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述正反馈识别切割反应的反应体系 以20μL计， 包括以下组分： 8 μL正反馈反应缓冲溶液、 50nM  gRNA‑T 2 μL、 1μM scgRNA 2 μL、 500nM aDNA 2 μL、 1 μM Cas12a蛋白4 μL和待测样品2 μL。 9.根据权利要求7或8所述的检测方法， 其特征在于， 所述正反馈识别切割反应的反应 程序为： 37℃下反应4h， 75℃处 理15min。 10.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述超支化杂交链式反应信号放大 反应的反应温度为20～3 0℃， 反应时间为2 ～3h。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921576 A 3