(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210747843.2 (22)申请日 2022.06.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114807454 A (43)申请公布日 2022.07.29 (73)专利权人 北京市疾病预防控制中心 地址 100013 北京市东城区和平里中街16 号 (72)发明人 张代涛　黄瑛　张新　沈玲羽　 潘阳　梁志超　冯兆民　李夫　 吕冰　崔淑娟　刘医萌　赵佳琛　 彭晓旻　卢桂兰　石伟先　杨鹏　 王全意　 (74)专利代理 机构 北京中知星原知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11868 专利代理师 王维佳　艾变开(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (56)对比文件 CN 111321252 A,2020.0 6.23 CN 112981011 A,2021.0 6.18 CN 113817871 A,2021.12.21 CN 112626272 A,2021.04.09 WO 2021183902 A1,2021.09.16 审查员 李慧敏 (54)发明名称 一种检测新型冠状病毒的变异位点的引物 组合物 (57)摘要 本发明涉及分子生物学检测技术领域， 具体 提供了一种检测新型冠状病毒的变异位点的引 物组合物及其应用。 本发明还提供了一种SARS ‑ CoV‑2的变异位点的检测方法， 所述的检测方法 将特异性引物组合物、 单碱基延伸反应以及基质 辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI ‑TOF MS 结合， 获得了灵敏度与特异性均为100%的技术效 果。 权利要求书1页 说明书7页 序列表9页 附图3页 CN 114807454 B 2022.09.02 CN 114807454 B 1.一种检测新型冠状病 毒的变异位点的引物组合物， 所述的引物组合物包含丰度扩增 引物和单碱基延伸引物， 其特征在于， 所述的丰度扩增引物如SEQ  ID NO： 1‑6所示， 所述的 单碱基延伸引物如SEQ  ID NO： 7‑18所示。 2.一种权利要求1所述引物组合物的应用， 其特 征在于， 所述的应用包括： A） 在检测SARS ‑CoV‑2的变异位 点中的非疾病治疗和/或诊断的应用； 或， B） 在制备治疗和/或诊断COVID ‑19的产品中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的SARS ‑CoV‑2的变异位点为SARS ‑ CoV‑2的omicro n株S基因的变异位 点。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 所述的试剂盒包 含权利要求1所述的引物组合物。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中还包含PCR或RT ‑PCR所 需试剂。 6.根据权利要求4或5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中还包含去磷酸化反 应试剂和/或单碱基延伸反应试剂。 7.一种SARS ‑CoV‑2的变异位 点的检测方法， 其特 征在于， 所述的检测方法包括： A） 用丰度扩增引物对待测样本进行PCR或RT ‑PCR扩增反应， 获得扩增产物， 所述的丰度 扩增引物如SEQ  ID NO： 1‑6所示； B） 将步骤A） 获得的扩增产物利用碱性磷酸酶进行去磷酸 化处理， 获得去磷酸 化产物； C） 用单碱基延伸引物对步骤B） 获得的去磷酸化产物进行单碱基延伸， 获得延伸产物， 所述的单碱基延伸引物如SEQ  ID NO： 7‑18所示； D） 将步骤C） 获得的延伸产物进行树脂脱盐纯化； E） 质谱检测； 所述检测方法为非疾病治疗和/或诊断。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述的SARS ‑CoV‑2的变异位点为 SARS‑CoV‑2的omicro n株S基因的变异位 点。 9.根据权利要求7 所述的检测方法， 其特 征在于， 所述的待测样本为 咽拭子或痰液。 10.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述的质谱为基质辅助激光解吸电 离飞行时间质谱， 所述的碱性磷酸酶为虾碱性磷酸酶。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807454 B 2一种检测新型冠状病毒 的变异位点的引物组合物 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测技术领域， 具体涉及 一种检测新型冠状病毒的变异位 点的引物组合物及其应用。 背景技术 [0002]新型冠状病毒 （SARS ‑CoV‑2） 的omicron株， 是一种高度变异的病毒， 具有很高的感 染风险， 通过基因检测结果证明， omicr on株增强的传播性与毒力与其spike蛋白 （S蛋白） 的 变异有关。 目前， Omicr on株的变异位点的检测主要依赖于实时荧光RT ‑PCR方法， 但是， 由于 实时荧光检测方法对于单基因突变的定性诊断有难度， 主要依赖于有变异与无变异检测的 CT值的差值 来判定结果， 对于病毒载量较低的样本， 鉴定难度很大。 发明内容 [0003]为解决上述问题， 本发明提供了一种复杂生物样品中痕量核酸的全方位研究的 SARS‑CoV‑2的omicron株的检测方法， 尤其在于S基因的变异位点的检测。 具有通量高、 检测 速度快、 成本低的特点， 该技术的检测效率、 检测通量均远高于荧光定量P CR检测， 而检测周 期又远低于传统的一代测序和二代测序， 少量的临床标本也可进行多基因多位点的检测。 具体的， 本发明根据变异位点区域成功设计和合成特异 性丰度扩增引物以及单碱基延伸引 物， 将扩增产物经消 化后对待测变异位点进行单碱基延伸， 延伸产物使用飞行时间质谱进 行分子量差异检测， 通过数据分析， 用于鉴定omicron株的全部特异性突变位点， 提高检测 效率， 减少检测成本， 为临床诊断提拱了强有力的技 术支持。 [0004]本发明的第一方面， 提供了一种检测新型冠状病毒的变异位点的引 物组合物， 所 述的引物组合物包含丰度扩增引物和 /或单碱基延伸引物， 所述的丰度扩增引物如SEQ  ID  NO： 1‑6所示， 所述的单碱基延伸引物如SEQ  ID NO： 7‑18所示。 [0005]所述的引物组合物可以扩增或检测SARS ‑CoV‑2， 优选检测SARS ‑CoV‑2的变异位 点， 进一步优选检测SARS ‑CoV‑2的omicron株S基因的变异位点， 更优选为检测痰液或咽拭 子 （口腔或鼻） 中的SARS ‑CoV‑2的omicron株S基因的变异位点。 所述的变异位点编码的蛋白 优选为G339D、 S371L、 S373P、 S375 F、 T376A、 N440K、 Q498R、 Y505H、 N764K、 D796Y、 G954K、 N969K 中的一种或两种以上的组合。 [0006]所述的扩增可以为PCR、 RT ‑PCR、 qPCR、 RCA、 S DA、 RPA、 LAMP等。 [0007]所述的引物组合物可以用于诊断COVID ‑19。 [0008]本发明的第二方面， 提供了一种上述引物组合物的应用， 所述的应用包括： [0009]A） 在检测SARS ‑CoV‑2的变异位 点中的非疾病治疗和/或诊断的应用； 或， [0010]B） 在制备治疗和/或诊断COVID ‑19的产品中的应用； [0011]C） 在检测SARS ‑CoV‑2中的应用； [0012]D） 在治疗和/或诊断COVID ‑19中的应用。 [0013]所述的SARS ‑CoV‑2的变异位点为SARS ‑CoV‑2的omicron株S 基因的变异 位点。 编码说　明　书 1/7 页 3 CN 114807454 B 3