(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210670364.5 (22)申请日 2022.06.14 (71)申请人 苏州西山 生物技术有限公司 地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区 东长路18号3 5幢 (72)发明人 芭菈蒂　李彤　杨玲焰　朱婷　 时长军　 (74)专利代理 机构 苏州新知行知识产权代理事 务所(特殊普通 合伙) 32414 专利代理师 郑丽玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧 光定量PCR方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍 尔德氏菌的荧光定量PCR(qPCR)方法， 步骤包 括： 从样本中提取DNA； 配置荧光定量qPCR反应的反 应体系； 荧光定量qPCR反应的反应程序为： 在PCR 仪中预变性20 ‑40s， 然后变性3 ‑6s， 然后退火延 伸25‑40s， 采集信号， 并按上述过程进行30 ‑60个 循环； 在所述整个体系扩增结束后， 读取循环数 Ct值以及扩增曲线， 根据循环数Ct值和扩增曲线 来进行检测结果的判断。 本发明采用实时荧光定 量方法操作简单快捷， 引物设计的局限性小， 且 无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性， 数 据分析更加简单直观； 检测时间大大缩短； 可检 测低至30拷贝数/反应,且探针法只与目的序列 结合， 显著提高了敏感性、 特异性和重复性。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图3页 CN 115074452 A 2022.09.20 CN 115074452 A 1.一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR(qPCR)方法， 其特征在于： 其包 括以下步骤： S1、 从样本中提取DNA； S2、 配置荧光定量qPCR反应的反应体系， 反应体系包括Premix  Taq酶、 上游引物、 下游 引物、 探针、 校正染料、 PCR专用水和DNA模板； S3、 荧光定量qPCR反应的反应程序为： 在PCR仪中预变性20 ‑40s， 然后变性3 ‑6s， 然后退 火延伸25 ‑40s， 采集信号， 并按上述过程进行3 0‑60个循环； S4、 在所述整个体系扩增结束后， 读取循环数Ct值以及扩增曲线， 根据循环数Ct值和扩 增曲线来进行检测结果的判断。 2.根据权利要求1所述的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qPCR方法， 其特征在于： 上 游引物的DNA序列为SEQ  ID NO： 1， 下游引 物的DNA序列为SEQ  ID NO： 2， 探针 的DNA序列为 SEQ ID NO： 3， 扩增片段15 3 bp。 3.根据权利要求1所述的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qPCR方法， 其特征在于： 步 骤S3中， 在荧光定量qPCR反应中， 在基因保守区域设计特异的实时荧光PCR引物和探针序 列， 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团， 探针完整时， 报告荧光基团 发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收， 检测不到荧光； 在PCR扩增时， Premix  Taq酶的5’ → 3’外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 报告荧光基团释放 并发出荧 光， 荧光能被检测仪器接收， 通过荧 光信号的强弱对PCR产物进行检测。 4.根据权利要求1所述的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR方法， 其特征 在于： 步骤S3中， PCR扩增采用的阳性质控质粒的制备方法是： 以p UC57为载体插入唐菖蒲伯 克霍尔德氏菌特异 性保守序列合成的质粒穿刺菌转 染到大肠杆菌D H5a中， 摇菌增殖后采用 质粒提取试剂盒提取纯化质粒， 用分光光度计测定浓度,并用无菌TE缓冲液将阳性质控质 粒浓度稀释至 3.0×1010拷贝数/ μL。 5.根据权利要求3所述的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR方法， 其特征 在于： 质粒合成序列为SEQ  ID NO： 4。 6.根据权利要求1所述的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR方法， 其特征 在于： 步骤S1中， 根据样本类型， 采用天根细菌、 口腔拭子、 血液/细胞/组织提取试剂盒， 来 提取样本的核酸DNA。 7.根据权利要求1所述的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR方法， 其特征 在于： 步骤S4中， 当有扩增曲线， 且Ct 值≤35,判断唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阳性； 当无扩增曲 线， 且Ct值显示Undet或N/A时， 或者有扩增曲线， Ct值＞37时， 判断唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 阴性； 当有扩增曲线， 35<Ct值≤37， 建议重复一次实验， 复孔检测， 若结果相同， 则判定35< Ct值≤36为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阳性， 36<Ct值≤37为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可疑， 建议 重新采样检测或将样本扩菌处理后， 重新提取测试； 若 无扩增曲线， 则判定为唐菖蒲伯克霍 尔德氏菌阴性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074452 A 2一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 特别是一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定 量PCR方法。 背景技术 [0002]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （Burkholderia  gladioli,  B. gladioli） 是一种广泛存 在于水、 土壤、 植物和水果中的革兰氏阴性细菌， 主要被鉴定为植物病原体。 形状为杆状， 需 氧兼微需氧， 有动力， 不发酵。 对于人体来说， 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是引起囊性纤维化患 者肺部感染的元凶。 对于动物来说， 免疫缺陷的小鼠会因为饮用受污染的水而被感染， 出现 头部倾斜症状。 [0003]该菌目前已发现有四个致病变型， B.  gladioli  pathovar  gladioli会导致唐菖 蒲和鸢尾的玉米叶病害； B.  gladioli  pathovar  allicola会导致洋葱鳞茎腐烂； B.gladioli pathovar  agaricicola会导致蘑菇软腐， B.gladioli  pathovar  cocovenans 会产生致命的毒素， 导致食物中毒。 在2004年的一项关于因中耳炎而导致头部严重倾斜的 无胸腺裸鼠研究中， 设计了一对针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16S  rRNA基因的特异引物， 并 对小鼠耳分泌物的样本进行PCR检测， 结果证实了该菌的存在。 最近， 有报道关于免疫缺陷 小鼠头部倾斜的病例， 通过飞行时间质谱方法确定病原体为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌， 研究 发现了是由于小鼠饮用了被污染的水而导致的感染。 人一旦感染上， 会引发慢 性肉芽肿、 肺 炎、 菌血症， 可能会导 致免疫抑制患者死 亡。 [0004]然而， 关于小鼠感染唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 的研究较少， 故本发明旨在建立一种 于基于Taqman探针的荧 光定量PCR方法， 用于检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的感染与否 。 [0005]目前来说， 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌主要通过非培养 的方法检测， 包括荧光原位杂 交(FISH)、 DNA微阵列、 普通PCR、 多重PCR、 实时荧光定量PCR和实时环介导等温扩增PCR (LAMP)。 [0006]在早期研究中， 使用选择性琼脂培养法和PC R‑RFLP方法来检测囊性纤维化(CF)患 者的痰液样本中的除B.  gladioli以外的洋葱伯克氏菌群(Burkholderia  cepacia  complex， BCC） ， 通过  recA 靶向基因 的PCR扩增和限制性片段长度多态性(RFLP)， 实现BCC 的快速检测。 结果表明， 在100个CF患者样 本中， 在19份培养阳性的痰样 本中检测到17个BCC 阳性， 另外的两个PC R阴性样品检测结果为B.  gladioli。 该检测方法的灵敏度为106 CFU / g 痰液， 这是由于该PCR方法的扩增片段较大， 为1040  bp， 为普通PCR方法， 敏感性不够， 所 以无法检测到较低水平的感染。 [0007]另一项研究是基于靶向16S和23S  rRNA基因序列的普通PCR法检测CF患者痰样本 中的B. gladioli， 达到快速区分B.  gladioli和BCC的目的。 将培养法检测需要的时间5天， 缩短为5小时， 但这项研究并没有提及检测的敏感性。 由于BCC和B.  gladioli与CF患者的肺 部感染密切相关， 因此对他们的种属特异性检测已成为临床研究的重点， 一些研究是通过 物种特异性PCR  (SS‑PCR)法快速鉴定这种细菌。 通过PCR法扩增23S  rRNA基因区域的序列，说　明　书 1/8 页 3 CN 115074452 A 3