(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210722111.8 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 湖南圣洲生物科技有限公司 地址 412007 湖南省株洲市天元区仙月环 路新马动力创新园 （中国动力谷） 6.1 期16栋 (72)发明人 徐进　张京红　赵哲浩　张媛媛　 徐刚伟　谭凯妮　姚湾　林曜华　 (74)专利代理 机构 北京劲创知识产权代理事务 所(普通合伙) 11589 专利代理师 田亚飞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测人NRAS基因突变的引物、 探针和试 剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测人NRAS基因突变的 引物、 探针和试剂盒， 属于分子生物学及生物技 术领域。 引物和探针针对2号外显子 上的Codon12 突变G12D、 Codon13突变G13D、 3号外显子上的 Codon61突变Q61K及3号外显子上的Codon61突变 Q61R， 试剂盒包含上述的引物和探针， 还包括内 参体系、 10 ×dPCR Buffer、 dPCR酶、 微流控芯片、 油相A和油相B。 本发明的有益效果在于： 本发明 所提供的人NRAS基因突变检测试剂盒通过数字 PCR平台， 将PCR反应置于微流控芯片中， 通过将 所检测模板更多的均匀分布于微流控芯片中， 极 大地有效的提高了检测的灵敏度和准确度， 检测 限可达20 0copies/mL。 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 CN 115029440 A 2022.09.09 CN 115029440 A 1.一种检测人NRAS基因突变的引物和探针， 其特征在于， 针对2号外显子上的Codon12 突变G12D的引物和探针的序列为： 正向引物NF1： 5 ′ ‑TGCTGGTGTGAAATGACTG‑3′； 反向引物NR 1： 5′ ‑CTGGATTAGCTGGATTGTCA‑3′； 检测探针NP1： 5 ′荧光基团‑AACACCATCTGCTC ‑3′猝灭基团； 封阻探针NB1： 5 ′ ‑CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT‑3′phosphorylati on； 针对2号外 显子上的Codo n13突变G13D的引物和探针的序列为： 正向引物NF2： 5 ′ ‑GGTGTGAAATGACTGAGTACA ‑3′； 反向引物NR2： 5 ′ ‑TGGTTCTGGATTAGCTGGA‑3′； 检测探针NP2： 5 ′荧光基团‑CAAC+A+T+CAC CTGCT‑3′猝灭基团； 封阻探针NB2： 5 ′ ‑CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT‑3′phosphorylati on； 针对3号外 显子上的Codo n61突变Q61K的引物和探针的序列为： 正向引物NF3： 5 ′ ‑AAACCTGTTTGTTGGACAT‑3′； 反向引物NR3： 5 ′ ‑ATTGGTCTCTCATG GCACT‑3′； 检测探针NP3： 5 ′荧光基团‑CTCTTCT+T+T+TC CAGC‑3′猝灭基团； 封阻探针NB3： 5 ′ ‑CTTCTTGTCCAGCTGTATC CAGTATGT ‑3′phOsphOrylati on； 针对3号外 显子上的Codo n61突变Q61 R的引物和探针的序列为： 正向引物NF4： 5 ′荧光基团‑CTCTTCTCGTCCAG‑3′猝灭基团； 反向引物NR4： 5 ′ ‑ATTGGTCTCTCATG GCACT‑3′； 检测探针NP4： 5 ′荧光基团‑CTCTTCT+T+T+TC CAGC‑3′猝灭基团； 封阻探针NB4： 5 ′ ‑CTTCTTGTCCAGCTGTATC CAGTATGT ‑3′phosphorylati on。 2.根据权利要求1所述检测人NRAS基因突变的引物和探针， 其特征在于， 所述荧光基团 为FAM、 HEX、 VIC、 ROX或C Y5； 所述猝灭基团为MGB、 BHQ1或BHQ2。 3.一种检测人NRAS基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1或2所 述的引物和探针， 还 包括内参体系， 所述内参体系引物和探针的序列为： 正向引物GF1： 5 ′ ‑GCTCCCTCTTTCTTTGCAG‑3′； 反向引物GR 1： 5′ ‑AGTCCTTCCACGATAC CAA‑3′； 内参探针GP1： 5 ′荧光基团‑TCCTGCACCACCAACTGCTTAG‑3′猝灭基团。 4.根据权利要求3所述检测人NRAS基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光基团为 FAM、 HEX、 VIC、 ROX或C Y5； 所述猝灭基团为MGB或Taqman探针。 5.根据权利要求3所述检测人NRAS基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 10×dPCR Buffer和dPCR酶。 6.根据权利要求5所述检测人NRAS基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述10 ×dPCR  Buffer包括Mg2+、 dNTP； 所述dPCR酶包括Taq酶和UDG酶。 7.根据权利要求6所述检测人NRAS基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述dNTP包括 dATP、 dGTP、 dCTP和dU TP。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029440 A 28.根据权利要求3所述检测人NRAS基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 微流控芯片， 所述 微流控芯片中的微腔室用于承载PCR反应 体系进行PCR扩增反应。 9.根据权利要求3所述检测人NRAS基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 油相A和油相B， 按照1∶3的体积比混合后， 通过50℃的加热后凝固， 用于封闭微流控芯片中 的微腔室。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029440 A 3