(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210625095.0 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 湖北省食品质量 安全监督检验研究 院 地址 430075 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区药监 二路8号 申请人 杭州优思达生物技 术有限公司 (72)发明人 王鸣秋　余祝君　刘艳　余军伟　 彭青枝　周艳琼　周陶鸿　张莉　 范志勇　李诗瑶　王遵浩　周倩　 臧伟庆　尤其敏　林艺志　 (74)专利代理 机构 深圳峰诚志合知识产权代理 有限公司 4 4525 专利代理师 张腾(51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的CPA引 物组合及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测产志贺毒素大肠埃 希氏菌的交叉引物核酸恒温扩增引物组合和方 法。 该引物组合用于检测stx1a、 stx1c、 stx1d、 stx2a、 stx2b、 stx2c、 stx2d、 stx2e、 stx2f和 stx2g共10种基因亚型， 包含核苷酸序列为SEQ   ID NO:1～5的引物组I， SEQ  ID NO:6～10的引物 组II,SEQ  ID NO:11～20的引物组III。 本发明提 供的方法操作简单， 特异性好、 灵敏度高， 可在 50min内完成核酸检测， 为监管部门对重大活动 保障和突发应急事件中食品致病菌检测提供快 速的筛查结果。 同时， 本发明首次设计筛选引物 组合实现STEC全部基因亚型的检测， 结合核酸检 测试纸条及一体化检测装置可实现全过程无仪 器依赖及可视化结果判断， 极大满足了现场检测 的需求。 权利要求书3页 说明书17页 序列表4页 附图2页 CN 114908179 A 2022.08.16 CN 114908179 A 1.一种检测产志贺毒素 大肠埃希氏菌的CPA引物组合， 由引物组I I或引物组I II组成， 引物组II， 用于检测待测物是否含stx1亚型STE C， 包括： 剥离引物stx1 ‑1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 剥离引物stx1 ‑2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 交叉引物stx1 ‑3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 检测引物stx1 ‑4的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示； 检测引物stx1 ‑5的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 引物组III， 用于检测待测物是否含stx2亚型STE C， 包括： 剥离引物stx2 ‑1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示； 剥离引物stx2 ‑2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 剥离引物stx2 ‑3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示； 剥离引物stx2 ‑4的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 交叉引物stx2 ‑5的核苷酸序列如SEQ  ID NO.15所示； 交叉引物stx2 ‑6的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示； 检测引物stx2 ‑7的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所示； 检测引物stx2 ‑8的核苷酸序列如SEQ  ID NO.18所示； 检测引物stx2 ‑9的核苷酸序列如SEQ  ID NO.19所示； 检测引物stx2 ‑10的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示； 检测引物stx1 ‑4/stx2‑7/stx2‑8的5'末端标记有异硫氰酸荧光素基团， 检测引物 stx1‑5/stx2‑9/stx2‑10的5'端标记有生物素荧 光基团。 2.含权利要求1所述的CPA引物组合的试剂， 其特 征在于： 含引物组I I的CPA反应 体系如下： 成分保存 浓度加样量 Bst酶5U/ μL  1～3 μL Bst酶缓冲液10X  2.5 μL 剥离引物stx1 ‑1为SEQ ID NO.6： 10 μmo l/L 0.5～1.5～ μL 剥离引物stx1 ‑2为SEQ ID NO.7： 10 μmo l/L 0.5～1.5 μL 交叉引物stx1 ‑3为SEQ ID NO.8： 10 μmo l/L 2.0～4.0 μL 检测引物stx1 ‑4为SEQ ID NO.9： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL 检测引物stx1 ‑5为SEQ ID NO.10： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL DNA样品5 μL 双蒸水补足体积至25 μL 总体积25 μL 含引物组I II的CPA反应 体系如下： 成分保存 浓度加样量 Bst酶5U/ μL1～3 μL Bst酶缓冲液10X  2.5 μL 剥离引物stx2 ‑1为SEQ ID NO.11： 10 μmol/L 0.5～1.5～ μL 剥离引物stx2 ‑2为SEQ ID NO.12： 10 μmo l/L 0.5～1.5 μL权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114908179 A 2剥离引物stx2 ‑3为SEQ ID NO.13： 10 μmo l/L 0.5～1.5 μL 剥离引物stx2 ‑4为SEQ ID NO.14： 10 μmo l/L 0.5～1.5 μL 交叉引物stx2 ‑5为SEQ ID NO.15： 10 μmo l/L 2.0～4.0 μL 交叉引物stx2 ‑6为SEQ ID NO.16： 10 μmo l/L 2.0～4.0 μL 检测引物stx2 ‑7为SEQ ID NO.17： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL 检测引物stx2 ‑8为SEQ ID NO.18： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL 检测引物stx2 ‑9为SEQ ID NO.19： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL 检测引物stx2 ‑10为SEQ ID NO.20： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL DNA样品5 μL 双蒸水补足体积至25 μL 总体积25 μL 其中Bst酶缓冲液的成分为200～500mM  Tris‑HCl、 100～300mM  (NH4)2SO4、 100～300mM   KCl、 20mM  MgSO4、 质量百分比1％～5％Trito n X‑100， 25℃环境下， pH值 为8.0～8.8。 3.一种检测产志贺毒素 大肠埃希氏菌的方法， 包括如下步骤： 步骤一， 提取待测样品DNA； 步骤二， 配制包 含引物组I的反应 体系， 各成分比例如下： 成分保存 浓度加样量 Bst酶5U/ μL1～3 μL Bst酶缓冲液10X2.5 μL 剥离引物uidA ‑1为SEQ ID NO.1： 10 μmo l/L 0.5～1.5～ μL 剥离引物uidA ‑2为SEQ ID NO.2： 10 μmo l/L 0.5～1.5 μL 交叉引物uidA ‑3为SEQ ID NO.3： 10 μmo l/L 2.0～4.0 μL 检测引物uidA ‑4为SEQ ID NO.4： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL 检测引物uidA ‑5为SEQ ID NO.5： 10 μmo l/L 1.25～3.25 μL DNA样品5 μL 双蒸水补足体积至25 μL 总体积25 μL 其中Bst酶缓冲液的成分为200～500mM  Tris‑HCl、 100～300mM  (NH4)2SO4、 100～300mM   KCl、 20mM  MgSO4、 质量百分比1％～5％Trito n X‑100， 25℃环境下， pH值 为8.0～8.8； 引物组I用于检测待测样品DNA是否含有大肠埃希氏菌； 步骤三， 将所述反应 体系充分 混匀， 恒温条件下进行扩增反应； 反应条件为6 0～67℃， 30～50min； 步骤四， 恒温扩增结束后， 用一次性核酸检测试纸条检测， 5mi n后观察结果； 结果判定： 如果无红线出现， 表明检测失败， 需要重新检测,若仅在质控区C出现一条红 线， 表示待测样品中未检出目标基因； 若 出现两条 红线， 一条检测线， 一条质控线， 表示待测 样品中检出目标基因； 步骤五， 若步骤四中出现两条红线， 配制如权利要求2所述的含引物 组II的反应体系和 含引物组I II的反应体系； 步骤六， 将含引物 组II的反应体系和含引物 组III的反应体系充分混匀， 恒温条件下进权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114908179 A 3