(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210641696.0 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 顾洁 地址 750000 宁夏回族自治区银川市 兴庆 区文化西街5 6号银川市妇幼保健院 (72)发明人 顾洁　袁娇　郭翠　赵娟萍　 戴国华　王丽颖　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 刘璞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测GJB 2耳聋基因c.188delT 突变位点 的引物探 针组合及方法 (57)摘要 本发明提供一种检测GJB2耳聋基因 c.188delT突变位点的引物探针组合及方法。 本 发明检测GJB 2耳聋基因c.188delT 突变位点的组 合物， 包括以下引物和探针； GJB2:c.188delT上 游引物： 5' ‑GAGCAGGCCGACTTTGTCTGC ‑3'； GJB2: c . 1 8 8 d e l T 下 游 引 物 ：5 ' ‑ TGATCTTCGTGTCCACGCCAGC ‑3'； 野生型探针： 5' ‑ AGGCTGCAAGAACATGTGCTAC ‑3'； 突变型探针： 5' ‑ AGGCTGCAAGAACAGTGCTAC ‑3'。 本发明提供了快 速、 准确和特异性高的检测GJB2:c.188delT突变 位点的方法。 权利要求书2页 说明书11页 序列表2页 附图1页 CN 115433772 A 2022.12.06 CN 115433772 A 1.一种检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的组合物， 其特征在于， 包括以下引物和 探针； GJB2:c.18 8delT上游引物： 5' ‑GAGCAGGCCGACTTTGTCTGC‑3'； GJB2:c.18 8delT下游引物： 5' ‑TGATCTTCGTGTCCACGCCAGC‑3'； 野生型探针： 5' ‑AGGCTGCAAGAACATGTGCTAC ‑3'； 突变型探针： 5' ‑AGGCTGCAAGAACAGTGCTAC ‑3'。 2.根据权利要求1所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的组合物， 其特征在于， 所述野生型探针、 突变型探针的5 ’端设有荧光基团， 在3 ’端或距离5 ’端8～12个碱基的位置 设有淬灭基团； 优选的， 在3 ’端或距离 5’端10个碱基的位置设有淬灭基团； 优选的， 在距离 5’端8～12个碱基的位置设有淬灭基团。 3.根据权利要求2所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的组合物， 其特征在于， 所述野生型探针的荧 光基团为FAM、 VIC、 ROX、 H EX或Cy5， 标记在5 ’端， 淬灭基团为BHQ。 4.根据权利要求2所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的组合物， 其特征在于， 所述突变型探针的荧 光基团为FAM、 VIC、 ROX、 H EX或Cy5， 淬灭基团为BHQ。 5.一种检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑ 4任一项所述检测GJB2耳聋 基因c.18 8delT突变位 点的组合物； 优选的， 还 包括(NH4)2SO4， 更优选(NH4)2SO4在PCR反应液中的终浓度为10 0～200 μM。 6.根据权利要求5所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括GJB 2:c.188delT上游引物、 GJB2:c.188delT下游引物、 野生型探针、 突变 型探针、 10 ×Ex Taq Buffer、 (NH4)2SO4、 dNTPs、 Ex  Taq HS、 超纯水； 优选的， GJB2:c.188delT上游引物在PCR反应液中的终浓度为150～200nM、 GJB2: c.188delT下游引物为150～200nM、 野生型探针为150～200nM、 突变型探针为150～200nM、 (NH4)2SO4为100～200 μM、 dNTPs为10 0～200 μM。 7.一种检测 GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的方法， 其特征在于， 针对待测样品， 利 用权利要求1 ‑4任一项所述检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的组合物或权利要求5 ‑6 任一项所述检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的试剂盒进行实时荧光PCR检测， 根据 PCR检测结果判定基因型别； 优选的， 所述待测样品为DNA样本， PCR反应体系中， DNA样本与PCR反应液的体积比为2: 18； 优选的， 用于检测的PCR反应程序为： 95℃， 5～10分钟， 1个循环； 95℃， 5～15秒， 60℃， 30～60秒， 5～10个 循环； 95℃， 5～15秒， 6 0℃， 30～60秒， 25～3 0个循环， 收集 荧光。 8.根据权利要求7所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的方法， 其特征在于， 通 过实时荧光PCR扩增， 获得荧光信号的Ct值， 通过比较不同荧光信号的Ct值， 判断目标基因 位点是否存在扩增， 从而判断基因型别。 9.根据权利要求7所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的方法， 其特征在于， 通 过荧光信号的Ct值和扩增曲线 进行判断基因型别； 优选的， 野生型探针荧光信号的Ct值小于16， 且有S型的扩增曲线， 突变型Ct值大于20， 判定为野生型； 野生型位点荧光信号的Ct大于16， 突变型Ct值小于20， 且有S型的扩增曲线，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115433772 A 2判定为纯合突变型； 野生型和突变型荧光信号的Ct值均小于20， 且均有S型的扩增曲线， 则 判定为杂合 突变型。 10.权利要求1 ‑4任一项所述检测 GJB2耳聋基因c.188 delT突变位点的组合物、 权利要 求5‑6任一项所述检测GJB2耳聋基因c.188delT突变位点的试剂 盒在检测GJB2:c.188delT 突变位点中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115433772 A 3