(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211076140.8 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 江苏海洋大学 地址 222005 江苏省连云港市海州区苍梧 路59号 (72)发明人 高嵩　赵陈洁　王佩　王昱　 谷庆花　 (74)专利代理 机构 南京专信知识产权代理有限 公司 326 05 专利代理师 郝晓燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型 检测方法 (57)摘要 本发明涉及病毒基因分型检测技术领域， 具 体涉及一种新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分 型检测方法， 本发明针对这个位点分别设计了野 生型和突变型的引物， RPA ‑ligation ‑qPCR方法 能够对新冠病毒关键突变E484Q进行基因分型， 不涉及昂贵的NGS设备， 整个过程可以在临床实 验室中常见的仪器上进行。 此外， 整个反应过程 不到1.5h， 大大缩短了检测时间。 该方法为当前 和未来新冠病毒关键突变的基因分型提供了一 种比NGS更便利的替代方法。 以RPA ‑ligation ‑ qPCR技术作为新冠病毒S蛋白E484Q基因分型具 有高灵敏度、 特异性强等优点。 权利要求书2页 说明书4页 附图2页 CN 115386659 A 2022.11.25 CN 115386659 A 1.一种新冠病毒S蛋白E484 Q突变的基因分型检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)利用特异性扩增引物1和引物 2， 使用RT ‑RPA反应体系扩增E484 Q位点的基因片段； (2)利用特异性扩增引物3、 4和5， 使用ligation反应体系对步骤(1)扩增产物进行处 理； (3)利用特异性扩增引物6和7， 使用qPCR反应体系对步骤(2)的反应产物判别基因分型 结果。 2.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(1)所述引物序列如下： 引物1： ACAGCA AATGGGTCGGGATCCGCTCCAGGGCAAACTGGAA； 引物2： GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG GCAACAGGGACTTCTGTGCAG。 3.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(2)所述引物序列如下： 引物3： TCAT TCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATGA AGTAACAATTAAAACCTTG； 引物4： TCAT TCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATGA AGTAACAATTAAAACCTTC； 引物5： PHO ‑AACACCATTACAAGGTGTGCCTGTGTCTGTGTA AATATCGTCTCT TTTTA。 4.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(3)所述引物序列如下： 引物6： TA AAAAGAGACGATAT TTACACAGACACAG； 引物7： TCAT TCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATG。 5.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(1)RT ‑RPA反应体系中， 引物1和引物2的浓度为10 μM， 模板与引物1和引物2混合体积比 例为1:2:2， 所述模板为E484Q位点的基因片段； 优选地， 步骤(1)RT ‑RPA反应通过添加2.5 μL 浓度为280mM的乙酸镁启动反应， 并在42℃孵 育30min。 6.根据权利 要求5所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(1)RT ‑RPA反应步骤如下： 向装有反应干粉的检测单元管中加入41.5 μL  A Buffer、 引 物1和2(浓度为10 μM)各2 μL、 105copies/ μL模板RNA  1 μL。 接着， 向检测单元管盖上加入2.5 μ L乙酸镁(280mM)启动反应， 混匀离心后在42℃下孵 育30min。 7.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(2)ligation反应体系， 引物3、 4和5的浓度为20nM， RT ‑RPA扩增产物与引物3、 4和5的混 合体积比例为1:1:1:1； 优选地， 步骤(2)ligation反应程序为： 混合反应物 瞬时离心后， 先 在95℃变性3mi n， 接着在6 0℃连接3min。 8.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(2)ligation反应步骤为： 在两个200μL管子中按顺序分别加入超纯水5.75μL， 引物5 (20nM)1 μL、 10 ×Taq DNA Ligase Buffer 1 μL,Taq DNA Ligase(40U/ μL)0.25 μL， RT ‑RPA扩 增产物1 μL。 然后， 一管中加入引物3(20nM)1 μL， 另一管中加入引物4(20nM)1 μL。 混合反应物 瞬时离心后， 先在95℃变性3mi n， 接着在6 0℃连接3min。 9.根据权利 要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤(3)qPCR反应体系， 引物6和7的浓度为10 μM， ligation反应产物与引物6和7混合比例为 1:0.4:0.4； 优选地， 步骤(3)qPCR反应程序为： 在9 5℃变性15s， 在60℃下退火和延伸30s， 45权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115386659 A 2个循环。 10.根据权利要求1所述的新冠病毒S蛋白E484Q突变的基因分型检测方法， 其特征在 于， 步骤(3)qPCR反应程序为： qPCR反应总体系为20μL。 首先， 在qPCR八连排管子中加入 Universal  SYBR qPCR Master Mix 10 μL,引物6  0.4 μL， 引物7  0.4 μL， 引物6和7的浓度 为 10 μM， 超纯水8.2 μL。 然后， 加入ligation反应产物1 μL。 混合反应物瞬时离心后， 设置qPCR反 应程序为： 95℃变性15s， 6 0℃退火和延伸3 0s， 45个循环， 实时检测荧 光强度。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115386659 A 3