(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210986368.4 (22)申请日 2022.08.17 (71)申请人 山东省科学院生物研究所 地址 250014 山东省济南市历下区科院路 19号 (72)发明人 靳梦　张秀军　任擎宇　王利振　 李宁　王荣春　孙晨　 (74)专利代理 机构 山东济南齐 鲁科技专利事务 所有限公司 37108 专利代理师 张娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A61K 49/00(2006.01)A61P 25/00(2006.01) (54)发明名称 一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷 在提神醒脑方面中的应用 (57)摘要 本发明公开了提神醒脑标志基因nr1d4a和 nr1d4b在筛选提神醒脑药物中的应用， 涉及药物 筛选技术领域， 具体为基于行为学指标和上述提 神醒脑标志 基因进行提神醒脑药物筛选的方法， 包括以下步骤： ①确定待筛选药物和对照药咖啡 因对5日龄斑马鱼幼鱼的最大安全浓度； ②基于 光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现， 筛选提神 醒脑药物； ③基于Real ‑time PCR技术， 检测各组 提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平， 筛选出提神醒脑药物； ④提神醒脑药物的判断标 准； 本发明的筛选方法， 操作流程短， 易操作， 筛 选结果准确高效， 将行为学表征和基因表达水平 相结合， 为以后提神醒脑药物的筛选提供了新的 方法。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115247211 A 2022.10.28 CN 115247211 A 1.提神醒脑标志基因在筛选提神醒脑药物中的应用， 其特征在于： 所述提神醒脑标志 基因为nr1d4a和nr1d4b。 2.基于行为学指标和权利要求1所述的提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方 法， 其特征在于： 包括以下步骤： ①确定待筛 选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全 浓度； ②基于光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现， 筛 选提神醒脑药物： 实验当晚24时， 将5dpf的斑马鱼幼鱼转移至48孔板中， 每孔一条鱼， 将上述斑马鱼幼鱼 分为对照药物组、 空白组和若干实验组， 其中对照药物组加入最大安全浓度的咖啡因， 空白 组加入1mL新鲜养鱼水， 每个实验组加入1mL最大安全浓度的一种待筛选药物； 每组均设置 三个平行 试验； 将上述48孔板放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中， 开始检测斑马鱼对光照刺激反 应， 检测时间为60分钟， 每分钟记录一次数据， 运用Zeblab软件进行数据处理， 计算斑马鱼 游动总距离和游动速度， 测试不同组别斑马鱼在沉睡时间下的光照刺激反应； ③基于Real‑time PCR技术， 检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平， 筛选出提神醒脑药物： 对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计引物序列： nr1d4a‑RT‑F： AGATATCGCATCAG GGTTCC， nr1d4a‑RT‑R： CTCGTTCTTCACGCACATCT， nr1d4b‑RT‑F： ATCAGGTCATGCTGCTGA AG， nr1d4b‑RT‑R： GCGTTCCTTAGCATTGAACA， 收集不同处理组行为学记录后的斑马鱼， 用养鱼水清洗两到三次， 转移至离心管中， 高 速离心后吸干上层液体， 留下底层斑马鱼组织； 使用RNA 提取试剂盒提取斑马鱼不同实验组 的总RNA， 利用超微量分光光度计测定RNA浓度， 使用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA， 参照 实时荧光定量PCR说明书， 以各组反转完成后的cDNA为模板， 加 入待测引物在qRT ‑PCR仪器 中扩增， 每组设置三个平行 试验， 检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平； ④提神醒脑药物的判断标准： 在沉睡时间下， 与空白组相比， 提神醒脑药物 的游动总距离变大， 游动速度增加， 反应 能力增强； 提神醒脑药物和对照药咖啡因的提神醒脑标志基因表达变化相同， 均为下调变 化。 3.根据权利要求2所述的基于行为学指标和利用提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物 筛选的方法， 其特征在于： ①确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓 度的具体步骤为： 将3日龄斑马鱼幼鱼随机分为空白组、 对照药物组和若干实验组， 每组鱼的数量相同， 将斑马鱼幼鱼置于2 4孔细胞培养板中， 每孔8～12条鱼， 对24孔细胞培养板投放不同梯度浓 度的待筛选药物浸泡3天， 每个浓度测试重复3次， 对斑马鱼的死亡率进行记录， 通过SPSS软 件计算确定实验组药物和对照组药物的最大安全 浓度。 4.根据权利要求2所述的基于行为学指标和利用提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物 筛选的方法， 其特征在于： 待筛选药物为远志 提取物、 酸枣仁提取物、 杜仲雄花提取物、 金盏 菊提取物和车叶草苷。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115247211 A 25.一种提神醒脑药物， 采用权利要求2 的方法筛选出来， 其特征在于： 所述提神醒脑药 物为车叶草苷。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115247211 A 3