(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210687908.9 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510610 广东省广州市天河区五山 华 南农业大 学 (72)发明人 聂庆华　符蓉　周震　张细权　 李卓航　徐海平　詹惠娜　郑茗　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 林佳纯 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的 分子检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种抗凝全血法鉴定鸡隐性 白羽基因型的分子检测方法及其应用， 属于分子 生物技术。 根据隐性白羽基因突变特征序列设计 三 条 特 异 性 引 物 ：N O R ‑U P ： ACCCCATCCCTG AAG ACACT ； MUT ‑UP ： TTGCGTCATTCCTTCCTTATCTA ； DOWN ： GCCCAGAGAGCACAGCAGTAAT。 利用该引物组合进行 PCR扩增反应， 通过观察反应产物凝胶电泳条带 就能鉴定鸡隐形白羽基因型。 该方法无需进行基 因组DNA的提取， 操作简单， 易于推广， 降低了鸡 隐性白羽基因型分子检测的成本， 有利于提高家 鸡品种选 育工作效率。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 114959064 A 2022.08.30 CN 114959064 A 1.一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的引物组合， 其特 征在于， 包括： NOR‑UP： ACCCCATCCCTGAAGACACT； MUT‑UP： TTGCGTCAT TCCTTCCTTATCTA； DOWN： GCCCAGAGAGCACAGCAGTA AT。 2.一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的试剂 盒， 其特征在于， 包含权利要求1所述 的引物组合。 3.一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 以鸡全血为模板， 利用权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒进行PCR 扩增反应， 对扩增产物凝胶电泳后进行辨别， 若电泳结果只出现一条542bp的条带， 则为非 隐性白羽基因纯合子， 若电泳结果只出现一条310bp条带， 则为隐性白羽基因纯合子， 若电 泳结果出现一条542bp条 带和一条310bp条 带， 则为携带隐性白羽基因的杂合子 。 4.根据权利要求3所述的方法， 所述模板为鸡抗凝全血。 5.根据权利要求4所述的方法， 所述鸡抗凝全血以双蒸水稀释后， 形成鸡抗凝全血双蒸 水稀释液， 作为模板 。 6.根据权利要求5所述的方法， 所述鸡抗凝全血与双蒸水的体积比为1： 2。 7.根据权利 要求3‑6任一项所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应条件为： 将配 制好的扩增反应体系放置于PCR仪中， 95℃预变性5min； 95℃变性15s， 61℃退火15s， 72℃延 伸30s， 35个循环， 72℃最终延伸5mi n， 4℃保存。 8.根据权利要求3 ‑6任一项所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系为： 2 × 血液样本缓冲 液5 μL、 鸡抗凝全血双蒸水稀释液1μL、 NOR ‑UP和MUT‑UP引物各0.2 μL、 DOWN引 物0.4 μL、 10mM脱氧核苷三磷酸0.2 μL、 血 液超保真DNA聚合酶0.3 μL和双蒸水2.7 μL。 9.一种权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在鉴定鸡隐性白羽基因 型中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述引物组合或所述试剂盒中引物NOR ‑ UP和DOWN用于非隐性白羽等位基因的检测， 引物MUT ‑UP和DOWN用于隐性白羽等位基因的检 测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959064 A 2一种抗凝全 血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方 法及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物技术领域， 特别是涉及一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基 因 型的分子检测方法及其应用。 背景技术 [0002]羽色与冠型、 体型性状等均是家禽是一种重要的外观表型性状， 作为品种的特征 性状之一而被农业工作者们广泛关注。 羽色的表型多种多样， 如白羽、 黄羽、 芦花羽、 横斑 羽、 麻羽等。 其中白羽性状可根据白羽基因的显隐性分为显性白羽和隐性白羽， 前者主要有 显型白羽基因I I控制、 后者主 要由隐性白羽基因c c、 oo、 PP和aa这4对隐性基因控制。 [0003]隐性白化基因aa定位在家鸡(Gallus  gallus domesticus)的1号常染色体的络氨 酸酶基因(Tyrosinase， TYR)上。 TYR基因第4内含子中插入一段长约 7.5kb的内源性逆转录 病毒， 导致TYR基因转录物中缺少第五外显子编码的跨膜结构域而无法正常转录， 从而使 TYR失去正常功能活性， 致使黑色素 无法合成， 导 致隐性白羽形成。 [0004]目前对家鸡的隐性白羽基因型在群体中进行鉴定的方法主要有两种， 第一种即通 过传统测交判断， 第二种则是通过分子检测技术。 在隐性白羽鸡的选育中， 分子手段相比传 统育种而言准确性高， 周期短， 工作步骤繁琐， 但同时也存在着需要一些专 业技术人员和一 定量的专业设备 的协助才可完成。 因此， 对隐性白羽 基因型检测的简单化和成本低廉化成 为了生产实 践中的迫切需求。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及 其应用， 以解决上述现有技术存在的问题， 利用本发 明公开的引物对抗凝全血模板进 行PCR 扩增， 经琼脂糖凝胶电泳分型后就能够鉴定鸡隐性白羽基因型， 该方法操作简单， 易于推 广， 并且对隐性白羽鸡的育种选 育提供理论基础和数据支持。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0007]本发明提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的引物组合， 包括： [0008]NOR‑UP： ACCCCATCCCTGAAGACACT； [0009]MUT‑UP： TTGCGTCAT TCCTTCCTTATCTA； [0010]DOWN： GCCCAGAGAGCACAGCAGTA AT。 [0011]本发明还提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的试剂盒， 包含所述的引物 组合。 [0012]本发明还提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： [0013]以鸡全血为模板， 利用所述的引物组合或所述的试剂盒进行PC R扩增反应， 对扩增 产物凝胶电泳后进 行辨别， 若电泳结果只出现一条542bp的条带， 则为 非隐性白羽基因纯合说　明　书 1/7 页 3 CN 114959064 A 3