(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210771152.6 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖镇 新罗区 东肖北路1号龙岩学院 (72)发明人 包银莉　许洵锴　郑灿阳　黄翠琴　 李世媛　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 齐宝玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种扩增猫冠状病毒S基因全序列 的引物、 方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种扩增猫冠状病毒S基因全 序列的引物、 方法和应用， 引物序列如SEQ  ID  NO.1～SEQ  ID NO.2所示； 方法包 括以下步骤:步 骤一、 提取病毒RNA； 步骤二、 cDNA合成； 步骤三、 PCR扩增； 步骤四、 基因片段检测及测序。 本发明 还提供了一种猫冠状病毒S基因全序列扩增方法 的应用， 用于对猫冠状病毒S基因全序列的检测 与分析。 本公开的扩增方法， 无需采用常规多对 引物进行拼接的方案， 通过设计1对引物即实现 了猫冠状病毒S基因S基因全序列的扩增， 不仅操 作便捷， 还 可以避免在高变区域无法扩增获得目 的片段的风险。 权利要求书1页 说明书6页 序列表7页 附图2页 CN 115261515 A 2022.11.01 CN 115261515 A 1.一种扩增猫冠状病毒S基因全序列的引物， 其特 征在于， 其核苷酸序列如下: 上游引物FCoV ‑S1： TACTTAGGACCATACTRTGAC； SEQ  ID NO.1； 其中， R为A或G； 下游因为FCoV ‑S2： ACTTCTCATAAACGGTGC； SEQ  ID NO.2。 2.权利要求1所述的引物制备扩增 和检测猫冠状病毒S基因全序列试剂盒中的应用。 3.一种扩增和检测猫冠状病毒S基因全序列的试剂盒， 其特征在于， 包括SEQ  ID NO.1 ～SEQ ID NO.2所示的引物， 其中， 上游引物为1 μL， 浓度为10pmol/ μL； 下游引物为1 μL， 浓度 是10pmol/ μL。 4.根据权利要求3所述的一种扩增和检测猫冠状病毒S基因序列的试剂盒， 其特征在 于， 还包括： 2×Green Taq Mix 12.5 μL、 cDNA  1 μL、 ddH2O9.5 μL。 5.一种扩增猫冠状病毒S基因的方法， 其特征在于， 提取病毒RNA， 反转录成cDNA， 以SEQ   ID NO.1～SEQ  ID NO.2所示的引物对cDNA序列进行扩增， 最后对 扩增片段进行 纯化。 6.根据权利要求5所述的一种扩增猫冠状病毒S基因的方法， 其特 征在于， 扩增程序为： 7.根据权利要求5所述的一种扩增猫冠状病毒S基因的方法， 其特征在于， 所述纯化为 采用FastPure  Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行 纯化。 8.一种猫冠状病毒S基因全序列扩增方法的应用， 其特征在于， 用于对猫冠状病毒S基 因全序列的检测与分析。 9.如权利要求8的应用， 其特征在于， 将扩增方法获得的产物， 测序后， 进行同源性比 对， 对所扩增的猫冠状病毒 进行分类。 10.如权利要求9的应用， 其特征在于， 所述同源性比对为将测序获得的序列与NCBI上 已知的猫冠状病毒S基因进行比对。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261515 A 2一种扩增猫冠状病毒S基因 全序列的引物、 方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及猫冠状病毒S基因全序列扩增技术领域， 更具体地说是涉及一种扩增 猫冠状病毒S基因全序列的引物、 方法和应用。 背景技术 [0002]猫冠状病毒是(Feline  Coronavirus， FCoV)是引起猫冠状病毒病的主要病原， 具 有两种生物型， 分别 为猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。 FECV主要感 染肠道细胞， 通常无症状或引起轻微的肠道症状， 如腹泻、 呕吐等， 偶尔引起严重的肠炎， 致 死率较低。 而FIPV的感染， 则 可导致猫腹膜急性、 烈性的炎症反应， 致死率极高。 研 究发现， FCoV在猫群种普遍流行， 且传播能力强， 感染率高， 在多猫家庭或流 浪猫收容所等卫生条件 相对较差的环境中较为多发， 严重威胁猫的健康。 [0003]FCoV属于套式病毒目、 冠状病毒科、 冠状病毒属成员， 是有囊膜的单链正股RNA病 毒， 全长29Kb左右， 具有典型的冠状病毒基因组结构， 包括 11个开放阅读 框， 分别编码4个结 构蛋白(S、 E、 M、 N)、 2个非结构蛋白(1a和1b)和5个辅助蛋白(3 a、 3b、 3c、 7a和7b)。 其中， S蛋 白， 即纤突蛋白， 是FCoV重要的结构蛋白。 研究证实， S蛋白在病毒的吸附和入侵宿 主细胞过 程中发挥着核心作用。 S蛋白的N端与宿 主细胞表面的受体结合， 可使病毒与细胞膜靠近， 并 参与膜融合。 S蛋白的C端参与病毒粒子的装配及蛋白的胞内运输， 并在一定程度上决定病 毒的致病性。 同时， S蛋白含有的抗原表位是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原。 此 外， 研究发现， S基因的突变可能与FECV向FIPV的转变有关， 尤其是在S1/S2裂解位点发生的 突变。 因此了解、 掌握FCoV编码S蛋白的S基因的变异情况， 有助于了解FCoV的基因重组、 抗 原变异、 病毒感染细胞机制和 基因变化规律， 对FCoV致病机制的研究和疫苗等防控措施开 发均有重要的指导 意义。 [0004]FCoV的S基因长度变化较大， 一般为4401bp左右。 且研究证 实， S基因多为冠状病毒 的高变区。 因此， 当前FCoV  S基因变异情况的研究主要通过选择S基因中部分序列片段进 行， 长度一般为200 ‑500bp左右， 无法准确反应整个S基因的变异情况； 或通过将将FCoV的S 基因分成多个相互重叠的基因片段进 行引物设计和扩增， 拼接后获得S 基因全长序列， 该方 法不仅工作量大， 而且 还存在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。 [0005]因此， 如何通过一次扩增 法即可实现对猫冠状病毒S基因全序列的扩增是本领域 技术人员亟需解决的问题。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明提供了一种扩增猫冠状病毒S基因全序列的引物序列。 通过对 NCBI上已知全基因组FCoV毒株的S基因上、 下游比对， 筛选获得其上下游保守区域， 设计1对 引物， 实现猫冠状病毒S基因全序列的扩增， 操作便捷， 避免了在高变区域无法扩增获得目 的片段的风险。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案：说　明　书 1/6 页 3 CN 115261515 A 3