(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211079466.6 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 山东恩诺基生物工程有限公司 地址 252000 山东省聊城市冠县崇文街道 办事处北环路168号冠县新兴产业园 C4栋 (72)发明人 牛成明　赵锋祥　胡顺营　曹凤阳　 王丙敬　苏永方　刘丽丽　种新禄　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能 的筛选方法 (57)摘要 本发明公开了一种快速分离鉴定益生菌种 属和益生功能的筛选方法， 筛选步骤分为益生菌 分离鉴定和体外抑菌效果试验， 所述益生菌分离 鉴定步骤如下： S1： 培养基准备， 采用LB固体和液 体培养基、 乳酸细菌培养基MRS固体和液体培养 基； S2： 菌液制备， 无菌采集盲肠内容物和黏膜， 置于无菌生理盐水中， 混匀； S3： 菌种分离， 分别 对乳酸菌类分离和芽孢杆菌分离； S4： 培养； S5： 初筛纯化， 进行乳酸菌纯化和枯草芽孢杆菌纯 化； S6： 鉴定。 本发明以鸡盲肠黏膜和粪便为原 料， 接种在LB和MRS培养基， 37摄氏度厌氧培养 24‑48h， 扩增产物送检生工测序， 测序结果通过 NCBI网站Blast分析， 快速鉴别细菌种属， 可 实现 对批量益生菌鉴定和能力筛查， 提高产能品研发 环节的开发效率。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 115287370 A 2022.11.04 CN 115287370 A 1.一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特征在于： 筛选步骤分为 益生菌分离鉴定和体外抑菌效果试验， 所述 益生菌分离鉴定步骤如下： S1： 培养基准备， 采用LB固体和液体培 养基、 乳酸细菌 培养基MRS固体和液体培 养基； S2： 菌液制备， 无菌采集盲肠内容物和黏膜， 置 于无菌生理盐水中， 混匀； S3： 菌种分离， 分别对乳酸菌类分离和芽孢杆菌分离； S4： 培养； S5： 初筛纯化， 进行乳酸菌纯化和枯 草芽孢杆菌纯化； S6： 鉴定。 2.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S2中： 菌液制备流程为： 选择健康 活鸡5只， 实验前1周禁止使用任何抗生素药物， 每只无菌采 集盲肠内容物和粘膜1g放置 于盛有45mL无菌生理盐水的离心管中， 涡旋混匀， 制成菌液。 3.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S3中： 乳酸菌类分离流程为： 采用无菌枪头从中吸取100ul悬液加入盛有900ul无菌生理盐水 的1.5ml离心管中充分混匀， 然后用无菌枪头从此离心管中吸取100ul加入另一盛有900ul 无菌生理盐水的1.5ml离心管中， 吹吸混合均匀； 以此类推， 制成10 ‑2、 10‑3、 10‑4、 10‑5不同稀释度的溶液， 用无菌枪头分别由10 ‑3、 10‑ 4、 10‑5三种稀释度中各吸取20 0ul， 分别滴在MRS固体培 养基表面中央位置； 用无菌涂布器涂布均匀， 室温下静置 5‑10min， 使菌液浸 入培养基。 4.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S3中： 芽孢杆菌分离流程为： 采用80℃水浴处理1h， 用无菌枪头从中吸取100ul悬液加入盛有 900ul无菌生理盐水的1.5ml离心管中充分混匀， 然后用无菌枪头从此离心管中吸取100ul 加入另一盛 有900ul无菌生理盐水的1.5ml离心管中， 吹吸混合均匀； 以此类推， 制成10 ‑2、 10‑3、 10‑4、 10‑5不同稀释度的溶液， 用无菌枪头分别由10 ‑3、 10‑ 4、 10‑5三种稀释度中各吸取20 0ul， 分别滴在LB固体培 养基表面中央位置； 用无菌涂布器涂布均匀， 室温下静置 5‑10min， 使菌液浸 入培养基。 5.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S4中： 将S3中菌液置 于培养基平板倒置 于37℃恒温培 养箱中， 培 养24小时。 6.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S5中： 乳酸菌纯化流程为： 挑取MRS培养基上形态不同的菌落编号， 分别在MRS培养基上划线 纯化， 37℃纯培 养24h， 后置 于4℃冰箱备用。 7.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S5中： 枯草芽孢杆菌纯化流程为： 挑取NA培养基上灰白色边缘波纹状表面粗糙的疑似菌落编 号， 在NA培 养基上划线纯化， 37℃纯培 养24h， 后置 于4℃冰箱备用。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115287370 A 28.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 基于益 生菌分离鉴定步骤的S6中： 鉴定采用测序的方法对纯化菌PCR扩增16sRNA序列进行测序， 通过NCBI网站Blast分 析， 确定菌株种类； 引物序列如下： 27F： AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1492R： TACGGYTACTTGTTACGACT； PCR扩增条件95℃5分钟； 95℃5秒、 5 6℃30秒、 72℃120秒3 5循环； 72℃10分钟。 9.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 所述体外抑菌效果试验的致病菌种类为： 奇异变形杆菌、 金黄色葡萄球菌、 大肠杆 菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 肠炎 沙门氏菌 。 10.根据权利要求9所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法， 其特 征在于： 试验步骤如下： SS1： 将分离出的益生菌接种到普通营养肉汤培养基或LB 液体培养基中， 37℃摇菌培养 18‑24h， 准备益 生菌菌液； SS2： 益生菌上清液制备： 上述 益生菌3000转/分钟， 离心5分钟， 吸取 上清备用； SS3： 0.5麦氏比浊菌液浓度配置： 吸取适量上述益生菌和致病菌菌液， 加入到1ml无菌 生理盐水中， 制成肉眼可 见轻微浑浊的0.5 麦氏比浊浓度的菌液； SS4:取200ul  0.5麦氏比浊度的致病菌菌液， 用涂布棒均匀涂抹在LB固体培养基上， 放 置灭菌处理的牛津杯4个， 用移液枪向每个牛津杯中加入200ul0.5麦氏比浊度的益生菌菌 液或上清液， 以无菌水作对照， 处理后平板放置在37℃培养24 ‑48h， 测量抑菌圈直径， 比较 各菌株活菌及培养上清液的抑菌能力大小， 筛选出对致病菌有抑菌圈的菌株作为优势菌 种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115287370 A 3