(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210576923.6 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 内蒙古大学 地址 010000 内蒙古自治区呼和浩特市玉 泉区锡林南路49 号内蒙古大学南校区 生命科学学院 申请人 内蒙古赛科星家畜种业与繁 育生物 技术研究院有限公司 (72)发明人 包斯琴　李喜和　张思雨　宋永利　 娜琴　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 专利代理师 崔玥 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01)C12N 15/12(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种山羊源OSKM及其构建方法与应用 (57)摘要 本发明提供了一种山羊源OSKM及其构建方 法与应用， 属于生物医学技术领域。 本发明提供 的构建山羊源OSKM的方法， 以山羊胚胎cDNA为模 板PCR扩增得到Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc基因； 以山羊 胎儿耳部成纤维细胞cDNA为模板PCR扩增得到 Klf‑4基因， 使上述四种基因各自带有2A肽序列， 得到四种基因片段； 使四种基因片段各自带有 15‑20bp的识别位点后， 和线 性化载体进行连接， 得山羊源OSKM。 采用本发明方法构建获得的山羊 源OSKM可成功诱导山羊成 纤维细胞重编程， 且重 编程效率高。 权利要求书2页 说明书9页 序列表4页 附图1页 CN 114752625 A 2022.07.15 CN 114752625 A 1.一种构建山羊源OSKM的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 以山羊体细胞为模板PCR 扩增得到Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc和Klf ‑4基因， 将Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc和Klf ‑4基因与线 性化载 体进行连接， 得山羊源OSKM； 所述扩增得到Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc和Klf ‑4基因的引物序列为： Oct‑4： F:ATGGCGGGACACC， R:TCAGT TTGCATGC； Sox‑2： F:ATGTACA ACATGA， R:TCACATGTGCGAG； c‑Myc： F:ATGC CCCTCAACG， R:TTAGGCGCAAGAG； Klf‑4： F:ATGAG GCAGCCAC， R:TTAAAAGTGCCTT。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 分别PCR扩增获得Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc、 Klf‑4基因时， 退火温度分别为54℃、 5 6℃、 60℃、 64℃。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述连接包括如下步骤： 以Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc、 Klf‑4基因片段为模板， 进行PCR扩增， 使Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc和Klf ‑4基因各自带有 2A肽序列， 得到四种基因片段； 以四种基因片段为模板， 进 行PCR扩增， 使 所述四种基因片段 各自带有15 ‑20bp的识别位 点， 然后与线性 化载体进行 连接。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 使Oct ‑4、 Sox‑2、 c‑Myc和Klf ‑4基因各自带 有2A肽序列的PCR引物为： Oct‑4+2A： F:ATGGCGGGACACCTCGCT R:aatcaaagttaagagtttgtttgacaggagcgacaattttTCAGTTTGCATGCAT； Sox‑2+2A： F:TACTCA AACTGGCTGGGGATGTAGA AAGCAATCCAGGTCCAATGTACAACATGATG R:aatcaaagttaagagtttgtttgacaggagcgacaatttttttTCACATGTGCGAGAG； c‑Myc+2A： F:TACTCA AACTGGCTGGGGATGTAGA AAGCAATCCAGGTCCAATGCCCCTCAACGTC R:aatcaaagttaagagtttgtttgacaggagcgacaatttttttTTAGGCGCAAGAGTT Klf‑4+2A: F:TACTCA AACTGGCTGGGGATGTAGA AAGCAATCCAGGTCCAATGGCTGTCAGCGAC R:TTAAAAGTGCCTCTTCATGT。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 使四种基因片段各自带有15 ‑20bp识别位 点的PCR引物为： Oct‑4+clon： F:gatcggccggatatcgaattcATGGCGGGACACCTCGCT R:ccccagccagtttgagtaAATCAAAGTTAAGAGTTTGTTTGACAGG； Sox‑2+clon： F:ttTACTCAAACTGGCTGGGGATG R:ccccagccagtttgagtaAATCAAAGTTAAGAGTTTGTTTGACAGG； c‑Myc+clon： F:ttTACTCAAACTGGCTGGGGATG R:cccagccagtttgagtaAAGATTTGGCTCAATTATATATTTGAAGG； Klf‑4+clon： F:cttTACTCAAACTGGCTGGGGATG R:aggcgcgccaagcttgcggccgcTTAAAAGTGCCTCTTCATGTGTA AGG。 6.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述线性化载体为： 酶切质粒PB ‑TRE‑hRL， 回收的载体PB ‑TRE骨架。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752625 A 27.采用权利要求1 ‑6任意一项所述方法构建所 得的山羊源OSKM 。 8.权利要求1 ‑6任意一项所述方法或权利要求7所述山羊源OSKM在诱导山羊成纤维细 胞重编程中的应用。 9.一种诱导山羊成纤维细胞重编 程的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 将重编 程载体 转入山羊成纤维细胞中， 培 养基培养， 所述重编程载体包括权利要求7 所述山羊源OSKM 。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述重编程载体还包括： pBase、 EF1α、 pNhL、 hRL和sLargeT质粒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752625 A 3