(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210638902.2 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 青岛农业大 学 地址 266000 山东省青岛市城阳区长城路 700号 (72)发明人 李和刚　都萌萌　林晓坤　张权威　 程明　赵金山　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 孙光远 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) (54)发明名称 一种山羊PIS基因型检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种山羊PIS基因型检测方 法， 属于生命科学领域。 包括： 4对特异性引物： SRYF和SRYR； PISwtF和PISwtR； PISvar ‑1F和 PISvar‑1R； PISvar ‑2F和PISvar ‑2R； 探针。 还提 供了具体的检测方法和检测标准。 本发明首次将 高灵敏度的PCR方法和高稳定性的Sout hernBlot 方法结合起来， 开发出简便高效的诊断山羊PIS 基因型的检测方法， 具有很高的特异性， 且方便 快捷， 可用于准确鉴定PIS基因的基因型， 指导山 羊的选种和选配， 根据育种者的需求控制或调整 山羊群体中PIS基因的基因型频率， 提高山羊养 殖的经济效益。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图6页 CN 114990111 A 2022.09.02 CN 114990111 A 1.一种山羊PIS基因型检测引物、 探针组， 其特征在于， 包括： 4对特异性引物： SRY  F和 SRY R； PIS wt F和PIS wt R； PIS var‑1 F和PIS var‑1 R； PIS var‑2 F和PIS var‑2 R； 探 针； SRY F： 5’ ‑GGGGCAATCGTATGCT TCT‑3’如SEQ ID No.1所示； SRY R： 5’ ‑CGGGTATTTGTCTCGGTGT‑3’如SEQ ID No.2所示； PIS wt F： 5’ ‑CTTGTGCCTCTTAGTCCTG‑3’如SEQ ID No.5所示； PIS wt R： 5’ ‑ACATAGAATGCCCTGGTG‑3’如SEQ ID No.6所示； PIS var‑1 F： 5’ ‑ATTTGCTGGCGTATTGAGTG‑3’如SEQ ID No.7所示； PIS var‑1 R： 5’ ‑AAGACGGTAGGTTCTGTGGG‑3’如SEQ ID No.8所示； PIS var‑2 F： 5’ ‑TCATAGGCCATAGCTA AATGGT‑3’如SEQ ID No.9所示； PIS var‑2 R： 5’ ‑GAGACAGGCTGAATGTGCAA‑3’如SEQ ID No.10所示； 探针： 5’ ‑TCATAGGCCATAGCTAAATGGTACTTAGAGAAATTTTTATAGATTTAAATACATTCATCAGACT ACAAATGAA GTGTAGGCATTAAAATTAA GAAACTTGAAGAATGTGTATGTACTTCCAAA GCAAAAATAA GAAAAAT AAGGGTATAACTCGCTTCTA GGGACTCA GGGGCAGTCTAATTTTCAA GCACTGAGAAGCCCA GATTAGTCTAATCA GTGCAAGCCTGTCTTTCAGTCCATTTAAAGATCCTTTGCACATTCAGCCTGTCTC‑3’如SEQ ID No.11所示。 2.根据权利要求1所述的一种山羊PIS基因型检测引物、 探针组， 其特征在于， 还包括特 异性引物对GAP DH F和GAPDH R； GAPDH F： 5’ ‑GTTTGTGATGGGCGTGAA‑3’如SEQ ID No.3所示； GAPDH R： 5’ ‑CTGTTGCTGTAGC CGAAT‑3’如SEQ ID No.4所示。 3.一种基于 权利要求1或2所述检测引物、 探针组的试剂盒。 4.一种基于权利要求1或2所述检测引物、 探针组或权利要求3所述的试剂盒在畜牧养 殖中的应用。 5.一种基于权利要求2所述检测引物、 探针组的山羊PIS基因型检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)引物设计： 包括遗传性别判定引物和PIS基因型鉴定引物； (2)进行遗传性别和PIS基因型鉴定； (3)制备探针并进行Southern杂交检测。 6.如权利要求5所述的山羊PIS基因型检测方法， 其特征在于， 步骤(2)包括： 样本基因 组DNA的提取； 遗传性别鉴定引 物SRY‑F/R、 GAPDH ‑F/R的PCR扩增； PIS基因型鉴定引 物PIS  wt F/R、 PIS var‑1F/R的PCR扩增； 所述扩增采用25 μL体系： 1.1 ×Golden Star Super PCR  Mix 22 μL， 模板DNA  1 μL， 上下游引物各 1 μL； 反应程序： 9 5℃预变性5min， 95℃变性30s， 退火 30s， 72℃延伸3 0s， 循环34次， 72℃复性5mi n， 4℃保存。 7.如权利 要求5所述的山羊PIS基因型检测方法， 其特征在于， 步骤(3)包括： 样本提取； PIS var‑2F/R引物 合成； 目的片段的回收与纯化； 克隆测序； 重组质粒的提取； 探针的制备； 探针的标记； 基因 组DNA的酶切； 酶切产物的电泳， 转膜， 杂交和洗膜、 信号检测； 其中， PIS var‑2F/R引物合成： 采用25 μL体系， 其中1.1 ×Golden Star Super PCR Mix  22 μL， 模板DNA  1μL， 上下游引物各1μL； PCR反应程序： 95℃ 预变性5min， 95℃变性30s， 60℃ 退火30s， 72℃延伸3 0s， 循环34次， 72℃复性5mi n， 4℃保存； 克隆测序： 载体为pGM ‑T载体， 反应体系： 10 ×T4 DNA Ligation  Buffer 1 μL， 3U/ μL  T4 权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990111 A 2DNA Ligase 1 μL， 50ng/ μL pGM‑T载体1 μL， 目的PCR片段 7 μL， 16℃过夜连接； 探针的制备： 以重组质粒为模板PCR合成探针， 在Taq酶的作用下， 将标记的单核苷酸掺 入到新合成的DNA链中， PCR扩增采用50 μL体系， plus  Mg2+10×buffer 5 μL， dUTP标记混合物 5μL， 上下游引物各1μL， Taq酶1μL， 重组质粒1μL， ddH2O 36μL； PCR反应程序： 95℃预变性 5min， 95℃变性3 0s， 55℃退火3 0s， 72℃延伸20s， 3 5个循环， 72℃复性7mi n， 4℃保存； 基因组DNA的酶切： 采用800 μL体系， 其中10 ×buffer 60 μL， BgI Ⅱ和EcoRⅠ各15 μL， 基 因 组DNA 30 μL， ddH2O 680 μL。 8.如权利要求5所述的山羊PIS基因型检测方法， 其特 征在于， 检测标准： 遗传性别： 有角母羊： 扩增产物只有一条579bp的条 带； 有角公羊： 扩增产物同时具有579bp和379bp两条 带； 无角母羊： 扩增产物只有一条579bp的条 带； 无角公羊： 扩增产物同时具有579bp和379bp两条 带； 间性山羊： 扩增产物只有一条579bp的条 带， 染色体为X X； PIS分型： 野生型纯合子有角山羊： 扩增产物只有214bp片段； 缺失突变纯合子间性 山羊： 扩增产物只有680bp片段， Southern杂交检测有条 带； 双缺失的纯合子无角公 羊： 扩增产物只有680bp片段， Southern杂交检测有条 带； 缺失突变杂合子无角山羊： 扩增产物同时具有214bp片段和680bp片段， Southern杂交 检测有条 带。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990111 A 3