(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211179977.5 (22)申请日 2022.09.27 (71)申请人 福州大学 地址 350100 福建省福州市闽侯县上街 镇 大学城新区学园路2号 (72)发明人 郭绍彬　林晶晶　石贤爱　 (74)专利代理 机构 福州科扬专利事务所(普通 合伙) 35001 专利代理师 郭梦羽 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6876(2018.01) (54)发明名称 一种尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法 和应用 (57)摘要 本发明公开一种尿苷二磷酸的核酸适体及 其筛选方法和应用， 核酸适体的序列如SEQ  ID  NO:1所示； 筛选方法为CIVT ‑SELEX， 即先采用 Capture‑SELEX方法进行初筛， 得到可以与目标 配体结合的单链核酸， 然后利用体外转录过程再 次进行筛选， 从而获得与目标配体结合后发生显 著构象变化的核酸适体。 本发明成功得到了既能 以单链线性的形式检测酶促反应液中的尿苷二 磷酸， 又可以在体外转录过程中响应不同浓度尿 苷二磷酸， 而对 下游基因转录做出激活调控的核 酸适体序列； CIVT ‑SELEX有希望应用于其他靶标 配体的适体序列筛选， 可用于检测和作为基因元 件应用于 基因回路中进行调控。 权利要求书2页 说明书8页 附图5页 CN 115537419 A 2022.12.30 CN 115537419 A 1.一种尿苷二磷酸的核酸适体， 其特征在于， 所述核酸适体的序列如SEQ  ID NO:1所 示。 2.一种尿苷二磷酸的核酸适体， 其特征在于， 为权利要求1中所述的SEQ  ID NO:1所示 序列的突变 体或截短序列或延长序列。 3.根据权利要求1或2所述的一种尿苷二磷酸的核酸适体， 其特征在于， 所述核酸适体 的5’端或3’端进行FITC、 氨基、 生物素或地高辛任一 化学修饰。 4.一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法， 用于筛选权利要求1或2所述核酸适体， 其特 征在于， 基于核酸 适体的体外SELEX筛 选方式和体外转录过程筛 选相结合。 5.根据权利要求4所述的一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： S1： 筛选文库的准备： 准备以下序列所示的随机s sDNA文库： 5’‑G CAACTCCTAG ATGG TCTCAAACG ‑N40‑GG ACTAG ATTCTA ‑N1 0‑ AAAAATGTGAGAC CAAAGGAGAATAA‑3’ S2： 将ssDNA文库与 3’端带有生物素标记的单链DNA  Capture‑Oligo互补配对形成部分 双链DNA； S3： 将经过S2所得的部分双链DNA与链霉亲和素磁珠进行过夜孵育， 使得ssDNA文库以 DNA Capture‑Oligo为媒介固定在链霉亲和素磁珠上， 洗去未能固定的ssDNA序列， 获得磁 珠‑CO‑ssDNA Library复合物； S4： 将经过S3所得的磁珠 ‑CO‑ssDNA Library复合物与靶标配体尿苷二磷酸进行孵育， 竞争结合与其有特异亲和力的s sDNA适体序列， 获得孵 育混合物； S5： 磁性分离经S4后的孵育混合物， 收集洗脱得到与人尿苷二磷酸特异性结合的ssDNA 适体序列， 即ssDNA富集文库， 并且在后续筛选过程中不断减少 靶标配体浓度， 增加 筛选压 力； S6： 将经过S5所得到的ssDNA富集文库进行PCR扩增， 其中PCR扩增用引物为： 引物P1： 5 ’ ‑GCAACTCCTAGATGGTCTCA‑3’； 引物P2： 5 ’ ‑AGTGAAAAGTTATTCTCCTTTGGTCTC‑3’； S7： 将经过S6扩增得到的富集后的带有磷酸化标记的dsDNA文库， 利用Lambda   Exonuclease在37℃水浴酶切30min得到ssDNA文库， 经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的 次级ssDNA文库； S8： 循环筛选： 将经过S7所得的次级ssDNA文库， 作 为下一轮筛选的次级文库， 并重复S2 ～S7的筛 选过程， 完成正向筛 选， 获得正向筛 选完成后的s sDNA文库； S9： 正向筛 选完成后的s sDNA文库， 进行体外转录过程筛 选。 6.根据权利要求5所述的一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法， 其特征在于， 所述S9的 体外转录过程筛 选的步骤如下： S9.1： 将正向筛选完成后的ssDNA文库经PCR扩增为dsDNA文库， 利用Golden  Gate  Assembly方法将带有启动子、 输出信号和终止子的载体与dsDNA文库进行连接， 获得连接产 物； S9.2： 将经过S9.1中插入有dsDNA文库的连接产物进行转化、 涂布、 挑菌、 Colony  PCR以 及凝胶电泳验证， 选择插入正确的条带， PCR产物回收其所对应的Colony  PCR后线性DNA产权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115537419 A 2物并进行编号； S9.3： 将所有回收得到的包含有启动 子、 适体序列、 输出信号以及终止子的线性DNA， 在 含有或不含有靶标尿苷二磷酸的体外转录系统中进行转录过程， 观察其输出信号的变化， 从而选择 可以对靶标配体做出响应， 影响下游基因转录的适体序列。 7.根据权利要求1或2中所述的一种尿苷二磷酸的核酸适体， 在识别、 分析和检测尿苷 二磷酸中的应用。 8.根据权利要求1或2中所述的一种尿苷二磷酸的核酸适体， 在基因回路中响应环境中 尿苷二磷酸水平的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115537419 A 3