(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211272344.9 (22)申请日 2022.10.18 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712199 陕西省咸阳市杨凌示范区 邰 城路3号 (72)发明人 陈亮　赵张晨　胡银岗　 (74)专利代理 机构 北京博识智 信专利代理事务 所(普通合伙) 16067 专利代理师 牛琳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标 记及在小麦上的应用 (57)摘要 本发明公开了一种小麦 矮杆基因Rht15紧密 连锁的KASP标记及在小麦 上的应用， 所述小麦矮 杆基因Rht15位于小麦6A染色体上， 与其紧密连 锁的KASP标记为6A ‑031， 所述小麦矮杆基因 Rht15与6A ‑031的遗传 距离为1cm； 所述KASP标记 6A‑031对应的引物包 括两条正向特异引物F ‑矮、 F‑高和一条共用反向引物R； 本发明还给出了所 述的小麦矮秆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在 筛选具有矮秆基因Rht15的小麦材料上的应用； 利用该分子标记可以在分子水平上快速筛选小 麦后代群体中含有矮秆基因Rht15的个体， 准确 性高， 大大提高了矮化育种效率。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115521992 A 2022.12.27 CN 115521992 A 1.一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记， 其特征在于： 所述小麦矮杆基因 Rht15位于小麦6A染色体上， 与其紧密连锁的KASP标记为6A ‑031， 所述小麦矮杆基因Rht15 与6A‑031的遗传距离为1cm； 所述KASP标记6A ‑031对应的引物包括两条正向特异引物F ‑矮、 F‑高和一条共用反向引 物R； 所述正向特异引物F ‑矮的核苷酸序列为5 ’GTCGATGA AGATGACGTGCA  3’； 所述正向特异引物F ‑高的核苷酸序列为5 ’GTCGATGA AGATGACGTGCG  3’； 所述共用反向引物R的核苷酸序列为5 ’CCCGCGAGAT TTATGGAGCA 3’。 2.根据权利要求1所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记， 其特征在于： 在合成KASP标记6A ‑031对应的引物时， 所述正向特异引物F ‑矮的5’端加上HEX荧光接头序 列， HEX荧光接头序列为5 ’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’； 所述正向特异引物F ‑高的5’端加上FAM荧光接头序列， FAM接头序列为5 ’ GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’。 3.一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在小麦上的应用， 基于权利要求1 ‑权 力要求2所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记， 其特征在于： 筛选步骤如下 所示： 步骤1、 检测： 采用KASP标记6A ‑031的引物， 对待测小麦材料的基因组DNA进行PCR扩增 和基因分型； 步骤2、 结果判断： 基于分型结果中显示为蓝色、 绿色的材料为具有矮杆基因Rht 15的小 麦材料； 结果显示蓝 色的材料为纯合矮杆材料； 结果显示绿色的材料为杂合矮杆材料； 结果 显示红色的材料为不含矮杆基因Rht15的高秆材料； 结果显示黑色的材料为阴性对照； 结果 显示紫色的材 料为分型失败的材 料。 4.根据权利要求3所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在小麦上的应 用， 其特征在于： 所述PCR扩增反应体系为5 μL， 包括2.5 μL的2 *KASP Master mix、 0.056 μL的 混合引物、 10 0ng的基因 组DNA、 超纯 水补足至 5 μL。 5.根据权利要求3所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在小麦上的应 用， 其特征在于： 所述混合引物包括两条正向特异引物F ‑矮和F‑高以及一条共用反向引物 R， 正向特异引物F ‑矮和F‑高的浓度各为12mM毫摩尔/升， 共用反向引物R的浓度为30mM毫摩 尔/升。 6.根据权利要求4所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在小麦上的应 用， 其特征在于： 所述PCR扩增的程序为： 94℃预变性15min， 94℃变性20s； 61℃退火60s， 每 循环一次降0.6℃， 10个 循环； 94℃变性20s， 5 5℃退火6 0s， 32个循环。 7.根据权利要求6所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在小麦上的应 用， 其特征在于： 所述检测指PCR扩增反应后用酶标仪读取终端荧光读数， 将数据导入软件 进行基因分型； 所用酶标仪的型号为FLUOstar  Omega， 基因分型的数据处理软件为 KlusterCal ler软件。 8.根据权利要求7所述的一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记在小麦上的应 用， 其特征在于： 若基因分型 的检测结果不明显， 可通过至少 3个补加循环后再进行基因分 型， 所述补加循环的程序为： 94℃变性20s， 57℃退火6 0s。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521992 A 2一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记及在小 麦上的 应用 技术领域 [0001]本发明涉及植物分子遗传育种技术领域， 具体是指一种小麦矮杆基因Rht15紧密 连锁的KAS P标记及在小麦上的应用。 背景技术 [0002]小麦是全球性的重要粮食作物， 全世界约有40％的人口以小麦为主食。 矮化育种 是获得小麦高产的重要途径， 20世纪60年代， 矮秆基因(Rht1和Rht2)引入小麦生产， 显著提 高了小麦的抗倒伏 性和耐高肥水能力， 使世界小麦产量大幅提升， 并引发了第一次 “绿色革 命”， 为解决粮食安全问题做出了巨大贡献。 然而， 当前小麦生产上应用的矮秆基因仍以 Rht1、 Rht2为主， 据统计， 世界上推广的小麦品种， 约有70％至少携带Rht1或Rht2中的一个 (Rebetzke  G J,Ellis M H,Bonnett  D G,Condon  A G,Falk D,Richards  RA.2011.The   Rht13 dwarfing  gene reduces peduncle  length and plant height to increase   grain number and yield of wheat.Field  Crops Research,124(31):323 ‑331)。 我国小 麦品种主要含矮秆基因Rht1、 Rht2和Rht8， 三者分布频率约为23.6～45.0％、 18.6～ 42.6％、 41.8～56.6％(张晓科， 中国小麦 矮秆基因和春化基因分布及 小麦品质相关性状多 重PCR体系建立， 博士后研 究工作报告， 中国农业科学院， 2007； 唐娜等， 矮秆基因对小麦部 分农艺性状的效应， 西北植物学报， 2010， 30(1)： 41 ‑49)。 矮秆基因在我国小麦品种中的分 布特点可能与所用矮源和遗传 背景有关。 我国小麦中Rht1矮源主要来自农林10和郑引4号； Rht2主要来自农林10号、 水源86、 辉县红和蚰包麦； Rht8则主要来自阿夫、 阿勃、 中农28、 郑 引1号等。 小麦矮秆基因的单一性， 不仅限制了小麦产量的进一步提升， 还使育成品种的遗 传基础日益狭窄， 遗传多样性降低， 不利于小麦的可持续发展。 近期研 究发现， Rht1和Rht2 在降低株高的同时， 会缩短胚芽鞘长度和苗期活力， 深播时会影响出苗(Ellis  M H, Rebetzke  G J,Chandler  P,Bonnett  D,Spielmeyer  W,Richards  R A.2004.The  effect  of different  height reducing  genes on the early growth of wheat.Functional   Plant Biology,31:583 ‑589)。 发掘 、 应用新的矮秆基因和矮秆种质， 对矮化、 抗倒伏育种具 有重要的意 义。 [0003]目前， 已经报道的小麦矮秆基因有25个， 除了Rht1、 Rht2、 Rht8在生产应用之外， 其 它矮秆基因尚未成功应用。 研究发现， 来 自硬粒小麦的矮秆基因Rht15在降低株高的同时， 不影响胚芽鞘长度和苗期活力， 且可显著提高抗倒伏能力， 具有较高的应用价值。 然而， 矮 秆基因Rht15尚未有准确、 高效的分子标记， 不利于分子标记辅助选择育种。 KASP (Kompetitive  Allele Specific PCR； 竞争性等位基因特异性PCR)， 可对广泛存在于基因 组DNA中的SNPs或InDels进行精准的判断， 是一种高通量、 经济、 有效的SNP分型技术。 开发 矮秆基因Rht15的KAS P标记， 有助于实现Rht15的分子标记辅助育种。 [0004]所以， 一种小麦矮杆基因Rht15紧密连锁的KASP标记及在小麦上的应用成为人们 亟待解决的问题。说　明　书 1/5 页 3 CN 115521992 A 3