(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210656771.0 (22)申请日 2022.06.11 (71)申请人 河北省农林科 学院石家庄果 树研究 所 地址 050051 河北省石家庄市学府路5号 (72)发明人 黄晶淼　王金鑫　李学营　郝婕　 索相敏　李梦　鄢新民　李建明　 冯建忠　周语潮　 (74)专利代理 机构 河北知亦可为专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 13115 专利代理师 陆文舒 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) A01H 6/74(2018.01)C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方 法 (57)摘要 本发明涉及红肉苹 果培育技术领域， 提出了 一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 包 括以下步骤： 步骤S1、 亲本选择； 步骤S2、 杂交授 粉； 步骤S3、 采果取种； 步骤S4、 播种育苗； 步骤 S5、 SSR分子 标记筛选合格幼苗； 步骤S6、 高接； 步 骤S7、 筛选优系； 步骤S8、 扩繁。 通过上述技术方 案， 解决了相关技术中红肉苹果口感差和 Ⅱ型红 肉苹果表型在童期不 易鉴定的问题。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 114868647 A 2022.08.09 CN 114868647 A 1.一种宜鲜 食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1、 亲本选择： 选 Ⅱ型红肉苹果为亲本一， 选普通苹果为亲本二； 亲本一的耐贮存 基因为纯合型MdACS1 ‑2， 亲本二的可滴定酸含量在0.2％ ‑0.5％之间， 可溶性固形物含量在 14％‑18％之间， 亲本一的S基因型和亲本二的S基因型不能完全相同； 步骤S2、 杂交授粉： 采集铃铛花或初开花， 剥出花药均匀摊在纸上， 置于20 ‑30℃的灯 光 下烤12h， 待花粉完全散出后选择无损的大蕾期花进 行授粉， 点授中心 花， 除去其余花朵， 对 完成授粉的花朵套袋并挂 牌； 步骤S3、 采果取种： 待杂交果成熟后， 采摘果实并取出种子、 晾干保存； 冬季对种子进行 沙藏处理； 步骤S4、 播种育苗： 对沙藏处理后的种子进行催芽， 白色芽体刚刚露出后， 芽体朝下播 种， 敷土并浇水； 步骤S5、 SSR分子标记筛选合格幼苗： 以已知为 Ⅱ型红肉和非 Ⅱ型红肉品种 的基因组 DNA为模板， 采用PCR技术筛选出与MdMYB110a位于同一条染色体的第一上游引物和第一下 游引物， 参考已知MdACS1引物作为第二上游引物和第二下游引物， 并分别计算第一上游引 物和第一下游引物的第一目标长度以及第二上游引物和第二下游引物的第二目标长度； 待 杂交苗长出7 ‑8片叶子后， 提取新鲜嫩叶的DNA， 利用锚定引物进行PCR扩增， 跑琼脂糖凝胶 电泳， 并根据最终得到的目标 条带的长度确定是否为 合格幼苗； 步骤S6、 高接： 对步骤S5中筛选出的合格幼苗进行促长， 选择120个节位以上的高位饱 满芽高接 于6年以上的大树上， 高接成活后， 刻芽、 拉枝、 促 花促果； 步骤S7、 筛选优系： 果实成熟后， 观察果肉颜色和果实耐贮性， 测定可溶性固形物、 可滴 定酸和果肉花青素含量； 其中， 果肉为红色， 果肉花青素含量≥2mg/100gFW， 可滴定酸含量 应在0.5％ ‑0.6％之间， 可溶性固形物含量应≥15％， 果实耐贮基因应为纯合型MdACS1 ‑2或 杂合型MdACS1 ‑2； 步骤S8、 扩繁： 待步骤S7中各参数满足要求时， 重复步骤S6至S7进行扩繁， 获得大量宜 鲜食耐贮存的红肉苹果 苗木。 2.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述步骤1中， 所述亲本一的S基因型与所述亲本二的S基因型完全不同时， 所述亲本一作父 本、 母本均可。 3.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述步骤1中， 所述亲本一的S基因型中非S 3基因与所述亲本二的S基因型之一相同时， 所述亲 本一作父本 。 4.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述步骤1中， 所述亲本一的S基因型中非S 3基因与所述亲本二的S基因型之一相同时， 所述亲 本一作母本 。 5.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述步骤1中， 所述亲本一和所述亲本二的S基因型均含有S3基因时， 所述亲本一作母本 。 6.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述第一上游引物的基因序列为ACCCGGAGTCATCCCTGTCTTA， 所述第一下游引物的基因序列为 CAAACTGGGCTTTCCGTTAGGT， 所述第一目标长度为393bp。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114868647 A 27.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述第二上游引物的基因序列为AGAGAGATGCCATTTTTGTTCGTAC， 所述第二下游引物的基因序 列为CCTACAAACTTGCGTGGGGATTATAAGTGT， 所述第二目标长度为6 55bp。 8.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述步骤S4中， 催芽需要的温度为20 ‑25℃， 需要的时间为12 ‑24h。 9.根据权利要求1所述的一种宜鲜食耐贮存 Ⅱ型红肉苹果的育种方法， 其特征在于， 所 述步骤S4中， 敷土厚度为1 ‑2cm。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114868647 A 3