(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210758636.7 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 中南民族大 学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区民族大 道708号 (72)发明人 刘娇　刘虹　覃瑞　向妮艳　 赛米热·艾山　 (74)专利代理 机构 武汉诚儒知识产权代理事务 所(普通合伙) 42265 专利代理师 刘天钰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 25/20(2019.01)G16B 30/00(2019.01) G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 一种大叶金腰S SR分子标记引物组合及应用 (57)摘要 本发明提供了大叶金腰SSR分子标记引物组 合， 所述引物组合包 括： 扩增cpSSR2的引物， 正向 及反向引物如SEQ  ID NO.1～2所示； 扩增cpSSR5 的引物， 正向及反向引物如SEQ  ID NO.3～4所 示； 扩增cpSSR11的引 物， 正向及反向引物如SEQ   ID NO.5～6所示； 扩增cpSSR12的引物， 正向及反 向引物如SEQ  ID NO.7～8所示； 扩增cpSSR23的 引物， 正向及反向引物如SEQ  ID NO.9～10所示。 本发明提供的大叶金腰SSR分子标记引物组合能 够对大叶金腰遗传多样性进行分析， 为大叶金腰 不同居群材料鉴定、 遗传进化分析提供可靠的标 记资源。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 115109866 A 2022.09.27 CN 115109866 A 1.一种大叶金腰SSR分子标记引物组合， 其特征在于： 所述SSR分子标记包括cpSSR2、 cpSSR5、 cpSSR11、 cpSSR12、 cpSSR23五组， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11～15所示； 所述引物组合包括： 扩增分子标记cpS SR2的引物， 正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1～2所示； 扩增分子标记cpS SR5的引物， 正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3～4所示； 扩增分子标记cpS SR11的引物， 正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5～6所示； 扩增分子标记cpS SR12的引物， 正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7～8所示； 扩增分子标记cpSSR23的引物， 正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9～10所 示。 2.权利要求1中所述大叶金腰SSR分子标记引物组合在大叶金腰种群遗传多样性分析 中的应用。 3.根据权利要求2所述的大叶金腰SSR分子标记引物组合在大叶金腰种群遗传多样性 分析中的应用， 其特 征在于： 具体步骤如下： (1)基因组DNA提取： 采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA， DNA质量和浓 度采用紫外分光 光度核酸测定 仪测定， 并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测 确认； (2)PCR反应体系： 对应配制五组， 每一组反应体系总体积为10μL， 包含2 ×T5 Super  PCR Mix(PAGE)5 μL、 10 μmo l·L‑1正反向引物各0.4 μL， 总基因 组DNA 1 μL， ddH2O 3.2 μL； PCR反应程序为： 98℃预变性2 min； 98℃变性10s， 58℃退火10s， 72℃延伸10s， 共35个循 环； 72℃总延伸2mi n后4℃保存； (3)电泳检测： 采用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离， 电泳缓冲液为1 × TBE， 90W恒压电泳1.5～ 2.0h， 银染检测引物的多态性， 拍照采集电泳图像； (4)数据分析： 根据电泳图像， 采用人工读带的方法， 将图上可重复的、 易分辨的条带记 为“1”， 同一位置无带计为“0”， 并将数据输入Excel建立原 始“01”数据矩阵； 利用NTSYS软件计算遗传相似系数， 并采用非加权配对算术平均法UP GMA进行遗传相似 性聚类分析； 运用GENDIVE  version3.06软件， 计算等位基因数Na、 有效等位基因数Ne、 观测杂合度 Ho和期望杂合度He等多样性指标。 4.权利要求1中所述大叶金腰SSR分子标记引物组合的获取方法， 其特征在于： 获取方 法包括以下步骤： (1)大叶金腰叶绿体 基因组序列获取及cpS SR位点鉴别 从GenBank公共数据库中下载大叶金腰叶绿体基因组序列MK973001， 利用MISA  perl脚 本软件搜索叶绿体基因组中分布的SSR位点， 获得初筛cpSSR分子标记的核苷酸序列； 检索 标准为： 单核苷酸、 二核苷酸、 三核苷酸、 四核苷酸、 五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重 复次数分别设置10、 6、 5、 5、 5和5次； (2)cpSSR引物设计 利用Primer  3软件对上步骤中初筛cpSSR分子标记的核苷酸序列进行引物设计， 引 物 设计原则 为： GC含量40～60％， 退火温度57～60℃， 引物长度18～23bp， 预计扩增产物长度 100～300bp； 获得初筛 cpSSR引物的核苷酸序列； (3)cpSSR引物二次筛 选权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115109866 A 2先采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA， 然后以此为模板， 对上步骤中的 初筛cpSSR引物均构建PCR反应体系， 进行PCR反应， PCR扩增结束后， 采用凝胶电泳对扩增产 物进行分离， 银染检测引物的多态 性， 拍照采集电泳图像； 选取其中稳定性好、 多态性高、 清 晰度高的电泳条 带所对应的引物， 即得到所述的大叶金腰S SR分子标记引物组合。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115109866 A 3