(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210628527.3 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 青岛大学 地址 266071 山东省青岛市崂山区香港东 路7号 (72)发明人 徐文华　李艳丽　刘伊明　董妍涵　 李濛　王萌远　 (74)专利代理 机构 青岛高晓专利事务所(普通 合伙) 37104 专利代理师 白莹　于正河 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种外泌体piRNA的用途 (57)摘要 本发明属于生物医学技术领域， 具体涉及一 种外泌体piRNA 的用途， 将血清来源的外泌体非 编码RNA piR‑hsa‑164586用于非小细胞肺癌的 早期检测和寻找用于克服癌症的潜在靶点， 通过 探究RNApiR ‑hsa‑164586对非小细胞肺癌 细胞系 功能的影响， 提高非小细胞肺癌的临床检测性 能， 具体过程是： 首先， 从组织、 细胞和血清外泌 体三个方面筛选出在非小细胞肺癌组织中显著 高表达的RNApiR ‑hsa‑164586； 然后， 通过构建 ROC曲线对RNA  piR‑hsa‑164586的检测性能进行 统计分析； 最后， 将RNA  piR‑hsa‑164586的表达 与非小细胞肺癌临床特征进行关联性比较和分 析， 进一步探究RNApiR ‑hsa‑164586的激动剂和 抑制剂对非小细胞功能的影 响， 为非小细胞肺癌 的早期检测提供了一种新型的血清标志物， 为克 服小细胞肺癌提供了潜在的治 疗靶点。 权利要求书1页 说明书10页 附图10页 CN 114959033 A 2022.08.30 CN 114959033 A 1.一种外泌体piRNA的用途， 其特征在于， 作为检测非小细胞肺癌的生物标志物和克服 癌症的潜在靶点。 2.根据权利要求1所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， 外泌体piRNA为血清外泌体 来源的， 与PI WI蛋白作用的非编码RNA  piR‑hsa‑164586。 3.根据权利要求2所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， piR ‑hsa‑164586的核苷酸 序列片段为TGAGA ACTGAATTCCATAGGCTGC， 引物为Human ‑piR‑hsa‑164586。 4.根据权利要求3所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， 上游引物序列Human ‑piR‑ hsa‑164586‑F为CGCGTGAGA ACTGAATTCCATA。 5.根据权利要求3所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， 下游引物序列Human ‑piR‑ hsa‑164586‑R为AGTGCAG GGTCCGAGGTATT。 6.根据权利要求2或3所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， RNA  piR‑hsa‑164586由 外泌体提取试剂盒从血清中提取， 通过TEM、 NTA和Western ‑Blot技术对RNA  piR‑hsa‑ 164586的结构进行验证。 7.根据权利要求2或3所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， RNA  piR‑hsa‑164586的 对非小细胞肺癌早期的检测效能的评估方法为： 通过构建ROC曲线将RNA  piR‑hsa‑164586 与生物标志物CYFRA21 ‑1的检测性能进行分析和比较； 对非小细胞肺癌术后的预后效果的 评估方法为： 通过qRT ‑PCR技术和构建ROC曲线评估同一组织术前和术后一周血清 来源外泌 体的RNA piR‑hsa‑164586判断手术对非小细胞肺癌组织的干预效果； 对非小细胞肺癌临床 特征的反映情况的评估方法为： 通过qRT ‑PCR技术评估血清来源外泌体的RNA  piR‑hsa‑ 164586的表达情况， 结合肺癌的临床特 征的相关性， 进行综合分析。 8.根据权利要求2或3所述的外泌体piRNA的用途， 其特征在于， RNA  piR‑hsa‑164586的 靶向作用效果的验证过程为： 将RNA  piR‑hsa‑164586转染入非小细胞肺癌A549和HCC2279 细胞系中， 通过CCK8试剂盒和Edu染色检测非小细胞肺癌细胞增殖指标， 根据非小细胞肺癌 细胞增殖指标判断RNA  piR‑hsa‑164586对细胞增殖活力的影 响； 通过Trann swell小室和划 痕实验检测非小细胞肺癌细胞迁移指标， 根据非小细胞肺癌细胞迁移指标判断RNA  piR‑ hsa‑164586对细胞迁移能力的影响； 通过流式细胞术检测凋亡指标， 根据凋亡指标判断RNA   piR‑hsa‑164586对细胞凋亡的影响。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959033 A 2一种外泌体piRNA的用途 技术领域： [0001]本发明属于生物医学技术领域， 具体涉及一种外泌体piRNA的用途， 作为早期检测 非小细胞肺癌的试剂盒， 以提高非小细胞肺癌的检测性能， 寻找克服癌症的潜在靶点。 背景技术： [0002]肺癌是癌症致死的首要原因。 根据美国癌症协会2021年的癌症数据分析显示， 提 高癌症诊断和治疗手段是肺癌死亡率下降的主要原因。 肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺 癌， 其中， 非小细胞肺癌的占比为80％ ‑85％， 由于癌症早期临床症状不明显且易与其他肺 部疾病混淆， 所以大约75％的患者被确认时已处于中晚期， 5年生存率很低。 目前， 肺癌临床 常用的检测方法包括组织病理活检技术、 电子计算机  X射线断层扫描技术和蛋白水平的血 清生物标志物。 但是， 其存在有创， 易引起并发症和假阳性率高等问题。 基于非小细胞肺癌 早期检测方法不佳， 一旦进展为中晚期， 将会对患者本身及家庭造成重担， 所以， 亟需研发 设计一种新型的检测生物标志物提高早期癌症的确认效率， 通过研究其在癌症发展过程中 的具体机制， 为克服癌症寻找新的靶点， 从而减轻病痛造成的严重后果。 [0003]外泌体是由活细胞分泌的直径为50 ‑150nm的多囊泡体， 可以将装载的多种物质如 蛋白质、 脂类和RNA转运到细胞外基质中去， 从而在细胞外环境中介导细胞间通讯。 由于外 泌体天然存在于包括血液、 尿液和乳汁的多种体液成分中， 所以， 可以通过检测体液中外泌 体包裹的内容物来对 疾病进行检测 和分析。 [0004]非编码RNA指的是从基因组上转录来 的不编码成蛋白质,而是在  RNA水平上直接 行使其生物学功能的RNA， 包括已知功能的RNA， 如  tRNA、 rRNA、 snRNA、 snoRNA和microRNA 等， 以及未知功能的RNA， 如与PIWI蛋白相互作用的RNA(PIWI  interacting  RNA,piRNA)。   piRNA是一类长度集中在29 ‑30nt、 表达具有组织特异性、 以高度特异链的方式与基因组相 对应的单链小RNA， 通过与Piwi亚家族蛋白结合形成的复合物行使其功能， 其表达失调在 疾 病的发生 发展中起着 重要作用， 如沉默转录基因过程， 调节翻译和维持mRNA的稳定性等。 已 有研究显示： piRNA存在于肿瘤来源的体液环境中， 其异常表达对肿瘤检测具有一定的参考 价值。 基于外泌体可以调节癌症细胞之间的信息通讯， pi RNA的表达具有组织特异 性且其异 常表达对癌症的进展发挥着 重要作用， 将血清来源的外泌体pi RNA作为生物标志物， 应用于 癌症早期检测， 研究其在癌症发生发展过程中的具体机制， 提高临床血清蛋白检测标志物 的性能， 寻找克服癌症的新型潜在靶点， 从而促进基因类标志 物向临床的转 化。 发明内容： [0005]本发明的目的在 于克服现有技术存在的缺点， 寻求设计一种外泌体piRNA的用途， 作为检测非小细胞肺癌的生物标志 物， 寻找克服癌症的潜在靶点， 提高癌症检测的效能。 [0006]为了实现上述目的， 本发明涉及的外泌体piRNA的用途为作为检测非小细胞肺癌 的生物标志物和克服癌症的潜在靶点； 外泌体piRNA  为血清外泌体来源的， 与PIWI蛋白作 用的非编码RNA  piR‑hsa‑ 164586； piR ‑hsa‑164586的核苷酸序列片段为  说　明　书 1/10 页 3 CN 114959033 A 3