(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210901847.1 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 中国农业科 学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 植物保护研究所 (72)发明人 张昊　杨美欣　冯洁　徐进　 许景升　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/20(2019.01) G16B 20/50(2019.01) G16B 30/00(2019.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基 腐病菌种 、 毒素类型和多菌 灵抗性的检测方法 (57)摘要 本发明涉及农作物病害检测、 鉴定及防治技 术领域， 公开了一种基于高通量测序鉴定小麦赤 霉和茎基腐病菌种、 毒素类型和多菌灵抗性的检 测方法。 包括以下步骤： S1： 扩增小麦赤霉病菌或 茎基腐病菌目的基因片段； S2： 混合扩增产物， 在 Illumina平台上进行高通量双端测序； S3： 采用 Python脚本一步自动化完成数据拆分、 序列比 对、 比对文件转换排序、 变异 检测和基因分析。 同 时， 脚本自动统计分型结果， 根据特异性SNP位点 鉴定引起赤霉病菌和茎基腐病菌的11个种镰孢 菌、 3种毒素化学型以及对4种杀菌剂多菌灵的抗 药突变类型。 开发的特异性barcode标签， 可以在 1个扩增子文库中特异性标记384个菌株。 本方法 适合大量病原菌的高通量检测， 能够为区域性病 害防控策略的制定提供重要依据。 权利要求书3页 说明书5页 附图1页 CN 115181813 A 2022.10.14 CN 115181813 A 1.一种基于 高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、 毒素类型和多菌灵抗性的检测 方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： S1 扩增片段： 采用带有barcode序列的引物扩增小麦赤霉病菌或茎基腐病菌DNA， 获得 TEF1α、Tri3和β‑tubulin基因目的片段； S2 高通量测序： 将所有菌株的PCR产物混合， 构建扩增子文库， 在Illumin a平台上进行 高通量双端测序， 每端读长为15 0bp； S3 测序数据拆分： 使用Python脚本调用 seqtk_demultiplex软件， 根据菌株特异性 barcode序列对测序数据进行拆分， 获得 单个菌株测序数据； S4 参考序列比对： 使用Python脚本调用bwa2软件将每个菌株测序数据与参考序列进 行比对； S5 比对文件排序： 使用Python脚本调用samtools软件将比对文件转换为二进制文件， 并排序； S6 覆盖度分析： 使用Pytho n脚本调用bedto ols软件计算 参考序列每 个位点的覆盖度； S7 SNP calling： 使用Python脚 本调用freebayes软件进行变异检测， 根据覆盖度和质 量值进行过滤； S8 基因分型： 使用Python脚本统计上述结果文件， 根据特异性SNP位点鉴定赤霉病菌 和茎基腐病菌的种 、 毒素化学 型以及对杀菌剂多菌 灵的抗药突变 类型。 2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、 毒素类 型和多菌 灵抗性的检测方法， 其特 征在于： 步骤S1中扩增目的基因片段 所采用的引物为： EF1S‑F： CTCATTTTCCTCGATCGCSC EF1S‑R： CTCGGCGGCTTCCTATTGWC TRI3F： AACCTGAGCCCTCCAGTCGT TRI3R： CGAGTATRATSGCAGCT TGGG TUB2F： GCTGACGCACTCTCTCG GCG TUB2R： CGGCCATGACGGTGGAAATC。 3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、 毒素类 型和多菌灵抗性的检测方法， 其特征在于： 步骤S1中扩增目的基因片段所采用的引物5 ’端 增加6个碱基组成的barcode序列， 用于区分不同菌株， 共有24组正向引物barcode序列和16 组反向引物barcode序列， 排列组合后最多能标记区分384株病原菌， barcode序列为： F1： AAGCGC F2： ATACG G F3： ATGGAC F4： ATCGGA F5： AGTACT F6： AGGCAC F7： AGCGCT F8： ACTAGC F9： ACGTAT F10： ACCTAT权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115181813 A 2F11： TATGAC F12： TAGGAC F13： TACTAC F14： TTAGCG F15： TTCCAG F16： TGTAGA F17： TGCA AC F18： TGCCGT F19： TCTACA F20： TCCAGA F21： GATACT F22： GAGTTA F23： GACGT T F24： GTACTA R1： GTGCCA R2： GGATTA R3： GGCACA R4： GCAGT T R5： GCTGTA R6： GCCTGA R7： CATGAG R8： CAGGAC R9： CTAATG R10： CTAGCG R11： CTGACT R12： CGAATT R13： CGTTAG R14： CGCAAT R15： CCAGTT R16： CCGTAT。 4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、 毒素类 型和多菌灵抗性的检测方法， 其特征在于： 步骤S4中所用参考序列为禾谷镰刀菌 TEF1α、 Tri3和β‑tubulin基因部分序列串联构成， 参 考序列为： CTCATTTTCCTCGATCGCGCGCCCTTTTCCCTTTCGAAATATCATTCGAATCGCCCTCACACGACGACTCGA TACGCGCCTGTTACCCCGCTCGA GGTCAAAAATTTTGCGGCTTTGTCGTAATTTTTTTCCCGGTGGGGCTCATACC CCGCCACTCGA GCGACAGGCGTCTGCCCTCTTCCCACAAACCATTCCCTGGGCGCTCATCATCACGTGTCAACCA G TCACTAACCACCTGTCAATA GGAAGCCGCCGAGNNNNNAACCTGA GCCCTCCA GTCGTCGACTCGCTGAAGTTGGA CGTAAGCACTCTTGGAACTGA GTTCGACGACAA GTGCACAGAATATACAA GTGCTCTTGTGGCTAATTATGTGA GT TGATATTCCGACTTCATCTCTCCCAGTACACACTAACCTTCTCATTACA GAAAAGCCGAGGTATGAAATTTCGACC权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115181813 A 3