(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210757568.2 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 鲲鹏基因 （北京） 科技有限责任公司 地址 102206 北京市昌平区生命科 学园生 命园路4号院7号楼5层5 01 (72)发明人 韩晋　潘彦鹏　柳丽萍　郭求真　 (74)专利代理 机构 北京博观达知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11977 专利代理师 曹阳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 一种基于荧光定量PCR技术检测肺炎链球菌 的引物探 针组及其试剂盒和应用 (57)摘要 本发明公开了一种TaqMan实时荧光定量PCR 检测肺炎链球菌的方法， 选取肺炎链球菌特异的 一段基因序列， 基于该特异基因序列， 设计引物 与TaqMan探针； 应用目标基因克隆质粒作为标准 品， 检测敏感性、 扩增效率等指标， 建立了肺炎链 球菌的实时荧光探针定量PCR检测方法； 除目标 菌外， 其它种属细菌的基因组DNA均无扩增 信号， 表明该方法具有很好的特异性， 能够满足一般样 品检测要求； 所设计的探针具有极高的敏感性， 最低检测限可达到102CFU/ml； 十倍倍比稀释标 准品， 3次重复实验均具有很好的重复性， 表明该 方法稳定， 数据可靠； 因此， 本发明建立的实时荧 光探针定量PCR方法是一种快速、 准确的检测肺 炎链球菌方法。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114854888 A 2022.08.05 CN 114854888 A 1.一种基于荧光定量PCR技术检测肺炎链球菌的引物和荧光探针组合， 所述引物包括 正向引物和反向引物，  其特征在于， 其中： 正向引物如序列表中SEQ  ID NO.1所示； 反向引 物如序列表中SEQ  ID NO.2所示； 所述 荧光探针如序列表中SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的引物和荧光探针组合， 其特征在于， 所述探针的5 ʹ端标记有荧 光基团， 3 ʹ端标记有淬灭基团； 所述 荧光基团包括FAM， 所述淬灭基团包括BHQ1。 3.一种肺炎链球菌核酸定量检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1或2所述的引物 和荧光探针组合。 4.根据权利要求3所述的肺炎链球菌核酸定量检测试剂 盒， 其特征在于， 所述肺炎链球 菌核酸定量检测试剂盒还 包括PCR缓冲液， 标准阳性模板和阴性模板 。 5.如权利要求1所述的引物和荧 光探针组合在制备肺炎链球菌检测试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854888 A 2一种基于荧光定量PCR技术检测肺炎链球菌的引物探针组及 其试剂盒和应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技术领域， 特别涉及一种肺炎链球菌核酸定量检测引 物、 荧 光探针及其试剂盒。 背景技术 [0002]肺炎链球菌 （Streptococcus  pneumoniae， SP） 属链球菌科链球菌属细菌， 革兰染 色阳性。 它不产生内、 外毒 素， 其致病性主要 是荚膜的侵袭作用： 无荚膜的变异株无毒力， 有 荚膜的肺炎球菌可抵抗吞噬细胞 的吞噬， 有利于细菌在宿主体内定居并繁殖。 根据细菌荚 膜的多糖抗原性可将肺炎链球菌分为多于90种血清型， 不同血清型 具有不同的致病性。 [0003]现有技术中对肺炎链球菌的快速检测 方法如下： 1、 传统的培养方法 （国标法） ， 即 从血液或胸腔积液培养 分离获得SP仍然作为诊断的金标准； 2、  乳胶凝集法， 该法是一种针 对肺炎球菌荚膜抗原的免疫学凝集方法； 3、 自动化方法， 目前微生物检测的自动化仪器已 普遍使用， 对于肺炎链球菌检测常见方法有： API20Strep鉴定试条、  VlTEK AMS系统、 PHOENIX  SMIC／ID鉴定板和MICRO—SAN  Walk Away等 ； 4、 免疫层析法 (Immunochromatography， ICT)， 目前广泛用于SP诊断的快速方法， 其检测为SP各血清型所 共有的抗原C多糖。 该方法可用于检测 尿液、 胸腔积液、 脑脊液和支气管灌洗液； 5、  核酸扩 增技术， PCR （Polymerase  Chain Reaction， 聚合酶链式反应） 属于一种核酸体外扩增技术， 靠寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增， 并采用凝胶电泳或探 针杂交检测扩增的DNA； 6、 实时荧 光定量PCR技 术。 [0004]荧光定量PCR靶向lytA （主要自溶蛋白基因） 和piaB （pia ‑ABC的通透基因转运体） 目前被用作荧光定量PCR肺炎链球菌检测的金标准。 现有技术CN102876774A公开了针对 lytA基因检测肺炎链球菌的引物和探针， 具有较高的， 但 其没有进 行灵敏度确认的实验。 同 时现有技术还有针对SP2020基因的实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法(T avares et  al. Identifcation  of Streptococcus  pneumoniae  by a real‑time PCR assay  targetin g SP2020, Nature， (2019)  9:3285)， 其指出， 使用SP2020， lytA基因和pi aB基因 作为靶基因时， 灵敏度分别为100%， 100%和 95.3%,特异性分别为99.8%,99.5%,99.5%,单独 检测一种靶基因不一定能够获得较高的灵敏度和特异性， 同时检测lytA和SP2020两种基因 可以实现最好的效果。 其它常用靶基因比如肺炎球菌溶血素基因ply、 肺炎球菌表面粘附A 基因psaA、 拓扑异构酶基因parE等的检测灵敏度都不够高。 可见， 本领域技术人员仍然需要 寻找能够提高荧 光定量PCR检测灵敏度和特异性的肺炎链球菌检测方法。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测样本中肺炎链球菌的荧光 定量PCR检测试剂盒及检测方法。 [0006]本发明的发明人发现， 肺炎球菌基因组中的编码RNA聚合酶σ因子(sigma ‑70 说　明　书 1/4 页 3 CN 114854888 A 3