(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210649248.5 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 上海市东方医院 （同济大 学附属东 方医院） 地址 200120 上海市浦东 新区即墨路15 0号 申请人 融智生物科技 （青岛） 有限公司 (72)发明人 吴文娟　张旻　胡靓　王玉玺　 刘东青　万菲菲　 (74)专利代理 机构 上海骁象知识产权代理有限 公司 31315 专利代理师 林炜 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/74(2006.01) (54)发明名称 一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药 基因的检测方法 (57)摘要 一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药 基因检测方法， 包括： 确定热带念珠菌的七种耐 药基因ERG11、FKS1、MDR1、TAC1、UPC2、MRR1、ERG3 及其SNP位点， 针对其中的SNP位点设计多重PCR 引物及MPE引物； 通过提取热带念 珠菌DNA并进行 多重PCR扩增， SAP消化后进行质量探针延伸反应 及树脂除盐， 然后质谱上机， 以核酸片段质荷比 的差异作为结果检测 信号， 对热带念 珠菌的耐药 基因序列有无突变进行快速判读 。 本发明具有周 期短、 通量高、 准确度高、 精确度高、 成本低等特 点， 为临床对于热带念 珠菌耐药基因的检测提供 了可靠有效的方法。 权利要求书2页 说明书12页 序列表20页 附图6页 CN 115491427 A 2022.12.20 CN 115491427 A 1.一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法， 其特征在于包括如下步 骤： 1)确定热带念珠菌的七种耐药基因ERG11、 FKS1、 MDR1、 TAC1、 UPC2、 MRR1、 ERG3及其SNP 位点； 所述的ERG11的基因序列如SEQ  ID NO.71所示； 所述的FKS1的基因序列如SEQ  ID  NO.72所示； 所述的MDR1的基因序列如SEQ  ID NO.73； 所述的TAC1的基因序列如SEQ  ID  NO.74所示； 所述的UPC2的基因序列如SEQ  ID NO.75所示； 所述的MRR1的基因序列如SEQ  ID  NO.76所示； 所述的ERG3的基因序列如SEQ  ID NO.77所示； 2)基于上述七种耐药基因的参考菌株序列， 针对其中的SNP位点设计多重PCR引物及 MPE引物； 3)通过提取热带念珠菌DNA并进行多重PCR扩增， SAP消化后进行质量探针延伸反应及 树脂除盐； 4)质谱上机， 以核酸片段质荷比的差异作为结果检测信号， 对热带念珠菌的耐药基因 序列有无突变进行 快速判读。 2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法， 其特征在于， 上述七种耐药基因ERG11、 FKS1、 MDR1、 TAC1、 UPC2、 MRR1、 ERG3的38个SNP位点如 下所示， 3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法， 其特征在于， 筛选纳入的耐药基因SNP位点包括与导致耐药有明确因果关系的确证位点和 因果关系尚未 得到证实的相关位 点。 4.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法， 其特征在于， 所述多重PCR引物和 MPE引物为人工设计， 其序列不属于任何已知的核酸引物 序列， 且两种引物之间不存在相互干扰。 5.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法， 其特征在于， 所述的多重PCR引物为15对， 其引物序列如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.30所示； 所述的MPE引物为 40个， 其序列如SEQ  ID NO.31～70所示。 6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115491427 A 2其特征在于， 所述多重P CR引物在同一反应温度及时间程序下， 有效完成所有基因序列的扩 增。 7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法， 其特征在于， 所述提取到的DNA浓度及纯度要求较低， 浓度大于0.1ng/ul， 纯度260/280为 1.6‑2.0， 260/230大于1， 即满足后续检测要求。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115491427 A 3