(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210702367.2 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 广东永诺医疗科技有限公司 地址 528000 广东省佛山市禅城区塱宝西 路82号第八层 (72)发明人 冼伟杰　罗景燕　蔡贞　许少飞　 朱丽敏　孔敏宜　叶月娥　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 许东辉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于微滴式数字PCR的BKV病毒检测试 剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 具体公开了一种 基于微滴式数字PCR的BKV病毒检测试剂盒。 所述 BKV病毒检测用引物， 由正向引物和反向引物组 成， 所述正向引 物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1 所示， 所述反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO: 2所示。 与引物配合使用的探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示。 本发明针对BKV病毒的特异性 保守区域进行靶点设计， 排除样 本中常见病原体 及基因组核酸干扰， 避免假阳性， 同时保守区域 的靶点选 择可以有效避免因BKV病毒变异和不同 血清型等因素影 响而导致的假阴性， 提高检测的 准确性和灵敏度。 权利要求书1页 说明书12页 序列表2页 附图3页 CN 115029485 A 2022.09.09 CN 115029485 A 1.一种BKV病毒检测用引物， 由正向引物和反向引物组成， 其特征在于， 所述正向引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示。 2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针， 其特征在于， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示。 3.如权利要求2所述的探针， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记有荧光基团， 3 ’端标记 有淬灭基团。 4.如权利要求3所述的探针， 其特征在于， 所述荧光基团包括FAM、 VIC/HEX、 ROX、 CY3、 CY5、 CY5.5、 CY7、 JOE、 TAMRA、 TET、 Texas  Red、 Quasar  570、 Quasar  670、 Atto  425、 Atto   590、 Alexa  Flour荧光基团中的至少一种； 所述淬灭基团包括Dabcyl、 Eclipse、 MGB、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 B BQ 650、 TAMRA、 TQ1 ‑TQ7淬灭基团中的至少一种。 5.一种基于微滴式数字PCR的BKV病毒检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括如权 利要求1所述的引物以及 如权利要求2 ‑4任一项所述的探针。 6.如权利要求5所述的BKV病毒检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还含有内标的引 物和探针， 所述内标的引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4‑5所示， 所述内标的探针的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:6所示。 7.如权利要求6所述的BKV病毒检测试剂盒， 其特征在于， 所述内标的引物 的工作浓度 为900nM， 所述内标的探针的工作浓度为375nM 。 8.如权利要求5所述的BKV病毒检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括微滴式数 字PCR用酶混合液、 阳性对照混合液和阴性对照混合液， 所述阳性对照混合液为含有BK病毒 的阳性尿液稀释而成， 所述阴性对照混合液包括正常人混合阴性尿液， 所述微滴式数字P CR 用酶混合液包括taq酶、 UDG酶和限制性内切酶。 9.如权利要求5 ‑8任一项所述的BKV病毒检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的应用 包括以下步骤： 1)获取样本的总DNA； 2)按照预设的反应数配置微 滴式数字PCR的反应混合液的总体积； 3)按照预设的反应数制备 各个反应 体系； 4)对各个经过微液滴处理的反应体系进行微滴式数字PCR扩增之后， 根据扩增结果计 算各个样本的核酸浓度。 10.如权利要求5 ‑8任一项所述的试剂盒的非诊断目的的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒用于检测来源于人体样本血清、 血浆或尿液中的BKV病毒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029485 A 2一种基于微滴式数字PCR的BKV病毒检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 尤其是涉及一种基于微滴式数字PC R的BKV病毒检测试 剂盒。 背景技术 [0002]BK病毒(BK  Virus， BKV)属于多瘤巨细胞病毒家族中的一个亚型， 目前认为BK病毒 主要的传播途径是呼吸道、 消化道， 其余传播途径包括通过胎盘、 器官移 植、 不洁食品、 血液 及血液制品等。 BKV是双链闭合环状DNA病毒， 无包膜， 含有约5300个碱基对。 可于免疫抑制 情况下再宿主的细胞核中复制， 且病毒具有一定的免疫抵抗能力。 BK病毒于1971年在英国 伦敦的病毒研究实验室， 首次从一名39岁男性接受肾移植患者输尿管中的尿液分离得到， 并以该患者名字首字母缩写命名。 根据记载， BK病毒在十岁儿童血清中的病毒阳性率平均 可达75％， 同时在尿液中检出较在血液中更为普遍。 BK病毒的初次感染大多发生在孩童时 期， 经由呼吸道传染， 通常没有症状或一些上呼吸道的轻微病症。 感染BK病毒后会潜伏且永 久躲藏于肾脏、 泌尿道、 淋巴组织以及脑中， 当宿主免疫力变差时会再度 活化而发病， 因此 正常人的尿液中也可以检测出病毒。 [0003]BKV原发感染多集中在婴幼儿时期， 通常无明显临床症状或表 现为发热、 轻微呼吸 道感染症状等。 随后病毒终生潜伏体内多个器官或组织， 其中常见 的部位是肾小管和尿道 上皮细胞。 BK病毒引起的发病可以导致出血性膀胱炎、 输尿管狭 窄及BK相关性肾病， 在肾移 植患者中可以导致移植肾功能异常， 甚至是移植肾脏功能丧失。 BKV对健康人并不致病， 但 当机体的免疫力降低或处于免疫抑制状态时， 潜伏于体内的BKV可被再次激活。 尤其是器官 移植后， 潜伏在尿路上皮和肾小管上皮中的BKV被激活， 开始高水平复制， 大量复制的病毒 颗粒从尿路中排泄， 造成BKV尿症。 在肾移植受者中， 随着病情进展， BKV会进入肾小管上皮 细胞细胞核并复制大量子代病毒， 引起细胞坏死、 松 解， 使组织 发生免疫性、 炎症性浸润； 当 肾小管上皮细胞脱落和局部基底膜暴露时， 病毒开始破坏肾小管毛细血管进入血液， 形成 BKV血症(BKV  viremia)。 BKV在血液中持续高载量表达， 进一步破坏移植肾组织导致肾小管 萎缩和间质纤维化， 最终形成BKVN。 [0004]由于BKVN早期表现为BKV尿症和BKV 血症， 定量聚合酶链反应法检测肾移植 受者尿 液、 外周血中BKV  DNA载量成为临床早期检测疾病变化的重要方法。 BKVN与尿液、 血液中BKV   DNA载量有密切关系， 当尿液BKV  DNA载量＞1.0 ×107copies/mL且血液BKV  DNA载量＞1.0 ×104copies/mL时， 病变发展成为BKVN的风险极高。 国内数据也证实， 血液BKV  DNA载量≥ 1.0×105copies/mL作为预测BKVN发生的阳性指标， 其阳性预测值高达83.3％。 因此， 血液 BKV DNA载量越 高， 发生BKVN的风险越大； 而对于血液检测阴性但尿液BKV  DNA载量高的患 者， 也需定期复查并警惕病情恶化。 [0005]实时荧光定量PCR技术是目前BKV  DNA检测应用最广泛的技术。 由于可以实现快 速、 灵敏检测， 大量文 献证实荧光定量P CR检测BKV  DNA对器官移植、 免疫性疾病等引起免疫 能力下降而导致的BKV载量变化监测具有重要的意义。 但由于不同实验室P CR平台间缺少统说　明　书 1/12 页 3 CN 115029485 A 3