(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210693762.9 (22)申请日 2022.06.18 (71)申请人 贵州大学 地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大 学北校区科 学技术处 (72)发明人 乔光　王贵　李蕊蕊　麦鹏坤　 (74)专利代理 机构 贵阳中新专利商标事务所 52100 专利代理师 李亮　李龙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种 质的IRAP分子标记引物及其 鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于反转录转座子鉴定 沙子空心李种质的IRAP分子标记引物， 其特征在 于： 所述的IRAP分子标记引物为Ty1 ‑6、 Ty1‑7、 Ty1‑9、 Ty1‑15、 Ty1‑18、 Ty1‑20、 Ty1‑25、 Ty3‑2、 Ty3‑3、 Ty3‑5、 Ty3‑6、 Ty3‑9、 Ty3‑14及Ty3‑16中 的一种或一种以上混合。 本发明从分子水平基于 反转录转座子的特性进行检测， 结果更为准确可 靠； 通过对数十种沙子空心李种质进行检测， 经 多次重复， 检测结果均保持一 致， 结果准确可靠 。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图5页 CN 114854900 A 2022.08.05 CN 114854900 A 1.一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记引物， 其特征在于： 所 述的IRAP分子标记引物为Ty1 ‑6、 Ty1‑7、 Ty1‑9、 Ty1‑15、 Ty1‑18、 Ty1‑20、 Ty1‑25、 Ty3‑2、 Ty3‑3、 Ty3‑5、 Ty3‑6、 Ty3‑9、 Ty3‑14及Ty3‑16中的一种或一种以上混合。 2.根据权利要求1所述的一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记 引物的筛 选方法， 其特 征在于： 所述的IRAP分子标记， 包括以下几个步骤： S1， 提取供试沙子空心李幼嫩叶片基因 组DNA； S2， 基于李反转录转 座子Ty1‑copia和Ty3 ‑gypsy的RT序列设计IRAP引物； S3， 取S1的DNA， 经PCR反应扩增过后通过1.5％琼脂糖凝胶电泳， 对设计 的引物进行初 步筛选， 保留具 备多态性， 条 带清晰的IRAP引物； S4， 利用初步筛选获得的IRAP引物对所有供试材料进行IRAP分子标记分析， 每个引物 重复2‑3次， 根据扩增条 带的有无、 多少及大小判定结果。 3.根据权利要求1所述的一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记 引物， 其特征在于： S3 中PCR反应最优体系为： 30ng/ μl模板DNA  1.0 μl， 引物1.3 μl， PCR  Mix  5.0 μl及2.7 μld dH2O。 4.根据权利要求1所述的一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记 引物， 其特征在于： S3中所述的PCR反应程序为： 94℃预变性4min， 94℃变性30s， 51℃ ‑58℃ 退火30s， 72℃延伸1mi n， 共40次循环， 72℃再反应10mi n， 4℃保存。 5.根据权利要求1所述的一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记 引物， 其特 征在于： S1中所述幼嫩叶片是指叶龄15 ‑20d新鲜或 ‑80℃下保存的叶片。 6.根据权利要求1所述的一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记 引物， 其特征在于： S3 中PCR反应所使用的Mix包括0.4mM  Taq DNA聚合酶、 0.4mM  dNTP、 4mM   MgCl2及0.4mM常规缓冲液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854900 A 2一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标记 引物及其鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 涉及利用李反转录转座子的RT序列开发IRAP引物、 PCR扩增体系确立及其应用。 背景技术 [0002]沙子空心李(Prunus  salicina  Lindl.cv'Shazikongxinli'),  蔷薇科李属植物， 是贵州省沿河县孕育的地方特色李品种， 2006年被评为国家地理标志保护产品， 其栽培历 史悠久， 口感独特。 沙子空心李一直是贵州沿河县的重点项目及经济支柱产业之一， 截至 2021年末为止， 沙 子空心李的种植 面积达4.5万亩， 年产量2万 余吨， 经济效益达 3.2亿元。 [0003]目前， 沙子空心李在长期的人工干预和自然变异下， 劣质基因微突变积累， 造成一 些原始优良种性逐渐减弱； 另外， 沿河县大力推广沙子空心李种植面积时， 不注重果园的科 学管理， 重栽轻管或栽而不管， 同时种苗繁育存在不规范、 来源众多等问题， 导致当前沙子 空心李生产出现果实成熟期不一， 果实品质参差不齐等现象， 损坏了沙子空心李的品牌声 誉。 目前沙子空心李在种质资源鉴定及指纹图谱构建等方面存在空 白， 没有明确的鉴定技 术， 因而有必 要开发一种高效准确的分子鉴定技术， 为沙子空心李优异种质的鉴别、 保存及 新种质挖掘提供服 务。 [0004]IRAP(逆转座子位点扩增多态性)是一种基于植物反转录转座子序列 间多态性的 分子标记， 目前已广泛应用于种质资源鉴定、 亲缘关系鉴别 及遗传多样性分析等方面， 具有 高通量、 基因组覆盖范围广、 多态性丰富及异质性高等优点。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题是： 提供一种异质性鉴定水平高、 分辨率好、 稳定可靠、 高效快捷基于基因水平上 的鉴定方法。 本方法可直接应用于沙子空心李种质资源鉴别、 指 纹图谱构建、 亲缘关系鉴定及遗传多样性分析， 为优异种质的保存、 辅助育种及种质产权保 护提供有效的手段。 本发 明需要解决的关键技术是高效I RAP引物的获得及  PCR扩增体系的 确立。 [0006]本发明的技术方案是： 一种基于反转录转座子鉴定沙子空心李种质的IRAP分子标 记引物及其鉴定方法， 其特征在于： 所述的IRAP分子标记引物为Ty1 ‑6、 Ty1‑7、 Ty1‑9、 Ty1‑ 15、 Ty1‑18、 Ty1‑20、 Ty1‑25、 Ty3‑2、 Ty3‑3、 Ty3‑5、 Ty3‑6、 Ty3‑9、 Ty3‑14及Ty3‑16中的一种 或一种以上混合。 [0007]所述的IRAP分子标记， 包括以下几个步骤： [0008]S1， 提取供试沙子空心李幼嫩叶片基因 组DNA； [0009]S2， 基于李反转录转 座子Ty1‑copia和Ty3 ‑gypsy的RT序列设计  IRAP引物； [0010]S3， 取S1的DNA， 经PCR反应扩增过后通过1.5％琼脂糖凝胶电泳， 对设计的引物进 行初步筛 选， 保留具 备多态性， 条 带清晰的IRAP  引物；说　明　书 1/7 页 3 CN 114854900 A 3