(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210744634.2 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 熊文广　谢龙飞　李燕红　郝杰　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA -CRISPR-Cas12a可视化检测鸭 疫里氏杆菌的试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a 可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用， 所 述试剂盒包含特异性crRNA、 鸭疫里氏杆菌特异 性RPA引物对和探针， 所述特异性crRNA的核苷酸 序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述特异性RPA引物对 的上游引物RPA ‑F、 下游引物RPA ‑R和探针的核苷 酸序列依次如SEQ  ID NO： 3～5所示； 探针5 ’端标 记荧光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 所述试剂盒具 有成本低， 操作便捷、 耗时少、 灵敏度高和特异性 强等特点， 全程在37～40℃环境下进行， 可以有 效脱离实验室大 型仪器的依赖 。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图3页 CN 115094122 A 2022.09.23 CN 115094122 A 1.一种组合物， 其特征在于， 所述组合物包括特异性crRNA、 特异性RPA引物对和探针； 所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示。 2.根据权利 要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述特异性RPA引物对的上游引物RPA ‑F 的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示， 下游引物RPA ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示。 3.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5 所示， 探针5 ’端标记荧 光基团。 4.根据权利要求1所述的组合物， 其特 征在于， 所述探针的3 ’端标记淬灭基团。 5.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述荧光基团为异硫氰酸荧光素或6 ‑羧 基荧光素。 6.根据权利要求 4所述的组合物， 其特 征在于， 所述淬灭基团为 生物素。 7.权利要求1～6任一所述的组合物在制备鸭疫里氏杆菌检测试剂盒中的应用。 8.一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒， 其特征在于， 所述 试剂盒包 含权利要求1～6任一所述的组合物。 9.根据权利 要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含Cas12/13专用核酸检 测试纸条， 所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线 T线和质控线C线。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述T线上包被有双抗， 所述C线上包被 链霉亲和素。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094122 A 2一种基于R PA‑CRISPR‑Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试 剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及微生物快速检测技术领域， 具体地， 涉及一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a 可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]鸭疫里氏杆菌病的临床表 现与其他细菌感染如多杀性巴氏杆菌、 大肠杆菌和肠道 沙门氏菌相似。 因此， 很难通过病理特征来诊断鸭疫 里氏杆菌感染。 诊断鸭疫 里氏杆菌感染 的实验室方法主要基于平板培养、 聚合酶链式反应、 环介导等温扩增、 酶联免疫吸附试验、 凝胶扩散沉淀试验和玻片凝集试验。 上述诊断方法的优点是具有较高的灵敏度、 特异性和 准确性， 但上述诊断方法通常需要较长时间， 方法比较繁琐或需要昂贵的仪器设备和高技 能的人员。 [0003]目前鸭疫里氏杆菌感染的确诊仍然以实验室方法为基础， 这限制了对鸭疫里氏杆 菌杆菌病的早期诊断， 早期发现， 早期治疗。 实验室方法的复杂性， 繁琐性也不利于鸭疫里 氏杆菌的大规模筛查。 开 发一种快速、 现场、 敏感、 特异的定量检测方法， 对于我国养鸭业具 有重要的战略意 义。 [0004]CRISPR‑Cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术， 成簇的规律间隔的短回文重 复序列(clustered  regularly  interspaced  short palindromic  repeats， CRISPR)及其 相关蛋白(CRISPR ‑associated  proteins,Cas)构成CRISPR ‑Cas系统。 CRISPR ‑Cas系统原 本 是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。 目前， 经过一系 列的改造， CRISPR ‑Cas技术 已在基因组编辑、 基因表达调控、 基因治疗、 病原体检测、 靶基因高通量筛选、 表观遗传修饰 等多个生命 科学的研究领域被广泛应用。 除了作为基因编辑工具， Ⅱ类Cas蛋白如Cas12a蛋 白具有的“附属切割 ”特性， 已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法， 在快速检测领 域具有重大潜力。 [0005]重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温扩增新技术， 广 泛用于病原菌核酸分子诊断。 RPA用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(PCR)所需的热循环。 不同于许多其他等温技术， RPA省去了升高或精确控温阶段， 扩增反应在25～ 42℃的温度范围内均可进 行， 反应通常在 5～15min内完成。 RPA技术自一出现就崭露头角， 因其具有反应迅速(5～15min)、 特异性强 (引物)、 低温运行( 25～42℃)、 样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、 灵敏度高(单拷 贝)、 适用性广、 试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和 检测形式多样等优势， 在核酸检测领域 得到了广泛应用。 [0006]但是由于RPA扩增产物需要琼脂糖凝胶电泳来分析结果， 使得该技术无法实施现 场的即时检测 。 近年来， RPA技术也引入荧光探针法， 使得检测结果可视化。 但是， 荧光探针 的设计复杂， 且探针的特异性不稳定， 假阳性的结果时有发生。 这在很大程度上限制了RPA 技术在快速诊断方面的应用。 [0007]将CRISPR ‑Cas12a检测系统与RPA技术结合， 通过RPA技术常温扩增目的片段， 然后说　明　书 1/8 页 3 CN 115094122 A 3