(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210732514.0 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 赣南师范大学 地址 341000 江西省赣州市 蓉江新区师院 南路1号赣南师 范大学 (72)发明人 李敏　段硕　龙云飞　秦宏坤　 程美琴　李玲　徐洲　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 吴波 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA -CRISPR-Cas12a体系检测黄 龙 病菌的crRNA和方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a 体系检测黄龙病菌的crRNA和方法， 属于植物病 理分子诊断技术领域， 所述crRNA的核苷酸序列 如SEQ ID NO:1所示； 所述检测方法基于重组酶 聚合酶扩增结合CRISPR ‑Cas12a技术。 本发明通 过RPA扩增及crRNA识别可双重特异地对柑橘黄 龙病菌进行检测， 特异性强， 且在灵敏度上可低 至2.01拷贝/μL， 可以更早发现感染柑橘黄龙病 的植株， 对柑橘黄龙病进行防治。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114854885 A 2022.08.05 CN 114854885 A 1.一种检测黄龙病菌的crRNA， 其特征在于， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所 示。 2.一种检测黄龙病菌的试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的crRNA。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括RPA引物， 所述RPA引物为F ‑RPA‑ RNRf和R‑RPA‑RNRr； 所述F ‑RPA‑RNRf核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示， 所述R ‑RPA‑RNRr核苷 酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 4.如权利要求2或3所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括Cas12a 蛋白、 ssDNA荧光探针。 5.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为FAM ‑ TTTATTT‑BHQ1。 6.一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系检测黄龙病菌的方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： (1)提取待测样品基因 组DNA； (2)以步骤(1)中的基因组DNA为模板， 利用权利要求3中所述RPA引 物进行等温扩增 反 应， 得到RPA扩增产物； (3)利用步骤(2)获取的RPA扩增产物， 以及Cas12a蛋白、 ssDNA荧光探针、 权利要求1所 述的crRNA分子在CRIS PR‑Cas12a反应 体系里反应， 得反应 体系溶液； (4)对步骤(3)的反应体系溶液进行荧光强度的检测， 当反应体系发出荧光， 则表示待 测样品感染黄龙病菌， 当反应 体系未发出荧 光， 则表示待测样品未感染黄龙病菌 。 7.如权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)所述含待测样品基因组DNA的提取包 括如下步骤： 在样品中加入含10～ 30mM NaOH的5～8％PEG200 溶液， 磨碎， 静置8～15min， 得 含有基因 组DNA的样品上清液。 8.如权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)所述等温扩增反应体系包括： RPA缓 冲液10 μL， F ‑RPA‑RNRf 0.8 μL， F‑RPA‑RNRr 0.8 μL， ddH2O 3.9 μL， 含有基因组DNA的样品上 清液1 μL和MgOAc  1 μL， 总体积为17.5 μL， 于 37℃反应15mi n。 9.如权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)所述反应体系包括： ssDNA荧光探针1 μL， 3 μL NEB缓冲液3.1， crRNA  1 μL， Cas12a蛋白4 μL， RPA扩增产 物10 μL， ddH2O 11 μL， 总体积 为30 μL， 于37℃反应6 0min。 10.如权利要求6～ 9任意一项所述的检测方法在鉴定柑橘黄龙病中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854885 A 2一种基于R PA‑CRISPR‑Cas12a体系检测黄龙病菌的crRNA和 方法 技术领域 [0001]本发明属于植物病理分子诊断技术领域， 尤其涉及一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a 体系检测黄龙病菌的crRNA和方法。 背景技术 [0002]黄龙病(HLB)是一种柑橘毁灭性病害。 由韧皮部杆菌属细菌(Candidatus   Liberibacter  spp.)引起， 分为韧 皮部专性寄生菌亚洲种(CLas)、 非洲种(CLaf)和美洲种 (CLam)。 CLas是通过亚洲柑橘木虱(Diaphorina  citri)或嫁接传播。 早期检测对于防止 CLas传播至关重要。 [0003]由于植物早期感染阶段CLas的浓度较低， 需要具有高灵敏度的检测技术。 HLB的诊 断技术多种多样， 聚合 酶链式反应(P CR)和定量PCR(qPCR)因其具有较高的灵敏度和特异性 而被广泛应用于CLas的检测， 然而， 这些技术严重依赖昂贵的设备和专 业人员， 且具有相对 较长的检测周期。 此外， 环介导等温扩增等多种等温扩增方法由于简单、 快速、 成本低等优 点， 已成为传统P CR方法的替代品， 然而， 由于非特异 性扩增信号的存在， 会导致假阳性的存 在， 将其应用于 CLas的准确检测具有一定的挑战性。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足， 提供一种 基于RPA‑CRISPR‑Cas12a体系检测黄龙病菌的crRNA和方法。 [0005]为了实现上述发明目的， 本发明提供了以下技 术方案： [0006]本发明提供了一种检测黄龙病菌的crRNA， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO: 1所示。 [0007]本发明提供了一种检测黄龙病菌的试剂盒， 包括所述的crRNA。 [0008]优选的， 所述试剂盒还包括RPA引物， 所述 RPA引物为F ‑RPA‑RNRf和R‑RPA‑RNRr； 所 述F‑RPA‑RNRf核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示， 所述R ‑RPA‑RNRr核苷酸序列如SEQ  ID NO:3 所示。 [0009]优选的， 所述试剂盒还 包括Cas12a 蛋白、 ssDNA荧光探针。 [0010]优选的， 所述s sDNA荧光探针的核苷酸序列为FAM ‑TTTATTT‑BHQ1。 [0011]本发明还提供一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系检测黄龙病菌的方法， 包括如下 步骤： [0012](1)提取待测样品基因 组DNA； [0013](2)以步骤(1)中的基因组DNA为模板， 利用所述RPA引物进行等温扩增反应， 得到 RPA扩增产物； [0014](3)利用步骤(2)获取的RPA扩增产物， 以及Cas12a蛋白、 ssDNA荧光探针、 所述的 crRNA分子在CRIS PR‑Cas12a反应 体系里反应， 得反应 体系溶液；说　明　书 1/5 页 3 CN 114854885 A 3