(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210705833.2 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 湖北省药品监 督检验研究院 地址 430075 湖北省武汉市东湖高新 技术 开发区高新大道6 66号 (72)发明人 汪波　胡敏　徐玲　王文斌　 李小芳　程华春　莫静　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6813(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于MLPA技术对中药材桃仁与苦杏仁 进行鉴别的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于多重连接探针扩增 技术对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 它 包括以下步骤： 1)提取样品基因组DNA； 2)以提取 的基因组DNA为模板， 利用特异性引物扩增桃仁 和苦杏仁的核基因片段并纯化扩增产物； 3)将 MLPA探针与纯化产物进行杂交； 4)利用DNA连接 酶将杂交产物进行连接； 5)利用通用引物对 连接 产物进行实时荧光定量PCR扩增； 6)收集熔解曲 线信号， 观测Tm值。 本发明能够在较短的时间内 快速鉴别中药材桃仁和苦杏仁， 并可有效检测出 掺混样品， 该方法具有特异性强， 灵敏度高等优 点， 在中药 材真伪鉴定领域有很好的应用前 景。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 115029473 A 2022.09.09 CN 115029473 A 1.一种基于多重连接探针扩增技术对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在 于包括以下步骤： 1)提取样品基因 组DNA； 2)以步骤1)的基因组DNA为模板， 利用特异性引物扩增桃仁和苦杏仁的核基因片段序 列并纯化扩增产物； 3)将MLPA探针与纯化产物进行杂交； 4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行 连接； 5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行实时荧 光定量PCR扩增； 6)收集熔解曲线信号， 观测Tm值， 其中， 所述MLPA探针共3条， 由特异性的桃仁、 苦杏仁左探针和共同右探针组成， 探针序 列如下： 桃仁左探针： 5 ′ ‑GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCGGCGCGCATCA AGGGCTCGAAAAAATGCTC‑3′ 苦杏仁左探针： 5 ′ ‑GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTTAATATCAAGGGCTCGAAAAAATTGCCG‑3′ 共同右探针： 5 ′ ‑GGCTCCAGCTCAGCT TTCAACGTCTAGAT TGGATCTTGCTGGCAC‑3′。 2.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于， 所述桃仁和 苦杏仁的核基因序列分别如SEQ  ID NO:8、 9所示。 3.如权利要求2所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于， 用于扩增所 述核基因序列的特异性引物的上游引物和下游引物序列如下； 上游引物:5 ′ ‑CCATCTACTC CTTCGGGAT‑3′ 下游引物:5 ′ ‑GTTCGCTCGC CGTTACTAG‑3′。 4.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于， 所述通用引 物的上游引物和下游引物序列如下： Primer F:5′ ‑GGGTTCCCTAAGGGTTGGA‑3′ Primer R:5′ ‑TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC‑3′。 5.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于： 所述DNA连 接酶为9°N DNA Ligase。 6.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于： 所述MLPA探 针中， 桃仁左探针、 苦杏仁左探针、 共同右探针的体积比为1.4： 0.2： 1.6 。 7.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于： 步骤3)中所 述杂交的反应条件为： 98℃变性5mi n， 68℃杂交20mi n。 8.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于： 步骤4)中所 述连接的反应条件为： 45℃15mi n连接左、 右探针， 98℃5mi n灭活连接酶。 9.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于： 步骤5)中所 述实时荧光定量PCR扩增反应条件为： 9 5℃1min； 95℃10s， 60℃5s， 72℃15s,35个循环； 72℃ 5min。 10.如权利要求1所述对中药材桃仁与苦杏仁进行鉴别的方法， 其特征在于： 步骤6)中， 通过观测样品熔解曲线峰和Tm值进 行鉴定， 若样品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为83.8℃ ±0.1℃， 则为桃仁； 若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为81.2℃ ±0.1℃， 则为苦杏仁； 若 样品出现双熔解曲线峰并且熔解峰Tm值分别为81.2℃ ±0.1℃和83.8℃ ±0.1℃， 则为桃仁权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029473 A 2与苦杏仁的混合样品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029473 A 3