(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210594468.2 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 安徽农业大 学 地址 230036 安徽省合肥市长江西路13 0号 申请人 安徽省动物疫病预防与控制中心 (72)发明人 宋祥军　祁钊　王景芳　杨侃侃　 涂健　邵颖　刘华　朱良强　陈曦　 王勇　王振宇　 (74)专利代理 机构 安徽申策知识产权代理事务 所(普通合伙) 34178 专利代理师 程艳梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫 血病毒的检测方法 (57)摘要 本发明涉及基因工程技术领域， 且公开了一 种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性 贫血病毒 的检测方法， 包括以下步骤： S1、 组织样品的处 理： 将称取约1g的各组织样品， 加入1mL  PBS后放 入研磨钵中研磨成匀浆， 转移至无菌离心管中， 在离心机中以8500rpm/min离心3min； S2、 病毒核 酸提取： 使用某生化科技有限公司的病毒基因组 DNA/RNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒RNA； 本 发明将CRISPR/Cas12a系统与ERA技术相结合， 建 立鸡传染性贫血病毒快速分子检测方法， 该方法 具有可视化、 敏 感性高、 特异性强、 不依赖贵重仪 器设备等优点， 整个检测过程只需1h左右， 为鸡 传染性贫血病毒快速诊断提供新的手段， 对免疫 抑制性病毒的监测具有重要意 义。 权利要求书3页 说明书10页 附图2页 CN 114774591 A 2022.07.22 CN 114774591 A 1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒的检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： S1、 组织样品的处理： 将称取约1g的各组织样品， 加入1mL  PBS后放入研磨钵中研磨成 匀浆， 转移至无菌 离心管中， 在离心机中以85 00rpm/min离心3mi n； S2、 病毒核酸提取： 使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(离心 柱型)提取病毒RNA； S3、 引物设计： 在GenBank 中检索鸡传染性贫血病毒全基因组， 通过Meglign软件分析比 对， 确定鸡传染性贫血病毒全基因组中高度保守片段vp2基因， 使用Primer  Premier 5软 件， 设计vp2基因的全长引物、 crRNA引物及探针， 根据筛选出的crRNA引物两端设计ERA引 物； 根据鸡传 染性贫血病毒VP2基因片段大小为651bp， 使用Primer  Premier 5软件设计全 长引物， 进行PCR扩增； S4、 PCR产物回收及纯化： 根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作， 把 扩增产物回收备用； S5、 标准质粒的构建： 根据pMD19 ‑T Vector Cloning Kit使用说明书， 构建pMD19 ‑T‑ VP2重组质粒； S6、 重组质粒鉴定： 取部分培养菌液进行测序服务， 并在NCBI网站的BLAST功能和 Meglign软件与VP2基因全长进行比对分析； S7、 质粒DNA小量抽提： 根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书， 提取构 建的pMD19 ‑T‑VP2重组质粒 备用； S8、 crRNA纯化： S81、 双链DNA的合成： 将上述合成的crRNA单链退火成双链， 反应体系为50 μL， 95℃退火 5min， 自然冷却至室温； S82、 转录： 将退火得到的双链进行转录， 转录所需DNA模板的用量应在0.1 ‑1μg， 轻轻混 匀各组分， 短暂离心， 37℃孵育2h， 程序结束后， 加入1 μL的DNase  1， 37℃消化15min， 去除模 板DNA； S83、 crRNA纯化： 将转录产物进行 纯化； S9、 CRISPR/Cas12a荧 光检测体系建立： S91、 引物筛 选： 对设计的三对鸡传染性贫血病毒crRNA引物进行筛 选， 对比结果； S92、 ERA引物设计及筛选： 使用预先合成的4对ERA引物， 根据ERA试剂盒说明书配置ERA 反应体系， 并设置ddH2O阴性对照， 先将冻干酶粉的反应管离心， 使管 中粉末沉于底部， 将配 制好的混合液加入含有冻干酶粉的反应管中， 震荡混匀使干粉管中的试剂重悬， 并简短离 心， 最后将2 μL激活剂加在反应管盖子上， 盖上管盖， 先振 荡混匀1s， 再离心1s， 重复两次后， 立即将反应管置于37℃水浴锅中反应20min， 反应结束后， 对ERA产物进行纯化， 使用DNA提 取液(酚氯仿)按1∶2的比例加入50 μL的DNA提取液， 震荡混匀后， 13000rpm离心五分钟， 吸取 上层液体， 加入L oading Buffer震荡混匀， 进行琼脂糖凝胶电泳跑胶分析。 2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒的检测方 法， 其特征在于： 所述 步骤S2具体为： S21、 用移液器将20ul  proteinase K加入一个干净的1.5ml离心管； S22、 向离心管中加入20 0ul血清；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114774591 A 2S23、 加入20 0ul Carrier RNA工作液， 盖上 管盖， 涡旋振荡15s 混匀； S24、 在56℃孵育15min， 简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体； S25、 加入520ul无水乙醇， 此 时可能会出现絮状沉淀， 盖上管盖并涡旋振荡15s， 彻底混 匀， 在室温下(15 ‑25℃)放置 5min； S26、 简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体； S27、 仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase ‑Free吸附柱CR2， 盖上管盖， 8000rpm离心1mi n， 弃废液， 将吸附柱放回收集管中； S28、 小心 打开吸附柱盖子， 加入500ul缓冲液GD， 盖上管盖， 8000rpm离心1min， 弃废液， 将吸附柱放回收集管中； S29、 小心打开吸附柱盖子， 加入600ul漂洗液PW， 盖上管盖， 静置2min， 8000rpm离心 1min， 弃废液， 将吸附柱放回收集管中； S210、 重复步骤S2 9； S211、 小心打开吸附柱盖子， 加入500ul无水乙醇， 盖上管盖， 8000rpm离心1min， 弃废 液； S212、 将吸附柱放回收集管中， 120 00rpm离心3mi n， 使吸附膜完全边干， 弃废液； S213、 将吸附柱放入一个RNase ‑Free离心管中， 小心打开吸附柱的盖子， 室温放置 3min， 使吸附膜完全变干， 向吸附膜的中间部位悬空滴加20 ‑150ul RNase‑Free ddH2O， 盖 上盖子， 室温放置 5min， 12000rpm离心1mi n。 3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒的检测方 法， 其特征在于： 所述步骤S3中， PCR体系为50 μL， 其中Mix25 μL， 上游引物2 μL， 下游引物2 μL， DNA模板2 μL， 灭菌水19 μL。 4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒的检测方 法， 其特征在于： 所述 步骤S83具体为： S831、 将转录产物RNase  free ddH2O补足至10 0 μL(RNA用量 不要超过10 0 μg)； S832、 加入3 00 μL Buffer RP， 涡旋混匀10s， 室温静置 5min； S833、 加入250 μL无水乙醇， 涡旋混匀15s， 若回收小分子RNA(＜200nt)， 加入600 μL无水 乙醇； S834、 将HiPure  RNA柱子套在收集管中， 把上述混合液转移至柱子中， 10000xg离心30 ‑ 60s， 当混合液＞70 0 μL时， 一次最多转移70 0 μL至柱子中， 多余的分次加入； S835、 倒弃滤液， 把柱子套回收集管中， 加入500 μL  Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至 柱子中， 静置2mi n， 10000xg离心3 0‑60s； S836、 倒弃滤液， 把柱子套回收集管中， 加入500 μL  Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至 柱子中， 10 000xg离心3 0‑60s； S837、 倒弃 滤液， 把柱子套回收集管中， 13 000xg离心2min； S838、 把柱子套在1.5 μL离心管中， 加入15 ‑30μL RNase Free Water至柱子膜中央， 放 置1min， 13000离心1min； S839、 若需获得最高产量， 重复上一 步进行第二次洗脱； S8310、 弃去柱子， 将RNA保存于 ‑20℃。 5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒的检测方权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114774591 A 3