(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210783143.9 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 梅余霞　范智玉　梁运祥　陈振民　 李英俊　刘洋洋　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 有限公司 1 1562 专利代理师 陈月霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青 枯菌的方法和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a ‑ LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒， 涉及病原 微生物检测领域。 本发明提供了一种青枯菌的 LAMP检测引物组， 包括上游外引物F3、 下游外引 物B3、 上游内引物FIP和下游内引物BIP。 本发明 还提供一种基于CRISPR/Cas12a ‑LAMP快速检测 青枯菌的试剂盒和方法。 本发明的检测方法将 LAMP的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测 方法结 合成为CRISPR/Cas12a ‑LAMP的分子检测方法， 该 方法具有良好的特异性、 敏感性、 重复性， 操作简 便快捷， 成本低廉， 不需要大型仪器设备， 具有快 速检测的的优势。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图4页 CN 115216552 A 2022.10.21 CN 115216552 A 1.一种青枯菌的LAMP检测引物组， 其特征在于， 包括如SEQ  ID NO.1所示的上游外引物 F3、 如SEQ  ID NO.2所示的下游外引物B3、 如SEQ  ID NO.3所示的上游内引物FIP和如SEQ  ID  NO.4所示的下游内引物BIP。 2.一种基于CRISPR/Cas12a ‑LAMP快速检测青枯菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 包括权利要求1所述的LAMP检测引物组、 如SEQ  ID NO.7所示的crRNA、 Lba  Cas12a和修饰荧 光基团和淬灭基团的如SEQ  ID NO.8所示的s sDNA探针。 3.根据权利 要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ基 团。 4.一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas12a ‑LAMP快速检测青枯菌的方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： (1)提取待测样品中的基因 组DNA； (2)以所述基因 组DNA为模板， 利用权利要求1所述的LAMP检测引物组进行LAMP扩增； (3)将步骤(2)得到的扩增产物在CRISPR/Cas12a反应体系中反应后， 进行荧光检测， 出 现荧光信号， 即为含有所述青枯菌； 所述CRISPR/Cas12a反应体系包括如SEQ  ID NO.7所示 的crRNA、 LbaCas12a和修饰荧 光基团和淬灭基团的如SEQ  ID NO.8所示的s sDNA探针。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述LAMP扩增反应的反应体 系为： 2.5μL  Isothermal  Amplification  Buffer I， 6mM Mg2+， 320U/mL  Bst 2.0 DNA  polymerase， 1.6mM  dNTPs， 0.1 μM  F3和B3， 0.8 μM  FIP和BIP， 模板DNA  1.0 μL， 加去核 酸酶水 补足至25 μL。 6.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述LAMP扩增反应的反应条 件为： 63℃扩增25mi n。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ基 团。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述CRISPR/Cas12a反应体系具体为： 30nM 的LbaCas12a， 30nM  crRNA， 3 μL  LAMP扩增产物， 3 μL  10X NEBuffer  R2.1， 0.8Μm  FAM‑BHQ 标记的ssDNA， 用DEPC水补至25 μL。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 在步骤(3)中， 所述扩增产物在CRISPR/ Cas12a反应 体系中的反应温度为37℃。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 在步骤(3)中， 所述扩增产物在CRISPR/ Cas12a反应 体系中的反应时间为20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115216552 A 2一种基于CRI SPR/Cas12a‑LAMP快速检测青枯菌的方 法和试 剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及病原微生物检测领域， 特别是涉及一种基于CRISPR/Cas12a ‑LAMP快速 检测青枯菌的方法和试剂盒。 背景技术 [0002]植物细菌性青枯病(Bacter ial wilt of plants)， 是由茄 科雷尔氏菌(Ralstonia   solanacearum， 简称青枯菌)引起的一种世界性重大病害。 作为一种生物分类学复杂的复合 菌种， 青枯菌寄主范围广泛， 可侵染54个科的450余种 植。 其中经济上重要的寄主包括马铃 薯、 西红柿、 辣椒、 茄子、 烟草、 生 姜、 桑树和香蕉等。 [0003]目前最为常用的青枯菌检测方法是平板划线分离技术， 该方法简单廉价， 但费时 费力， 且操作人员需具备准确识别青枯菌菌落形态的能力。 血清学检测 技术是基于抗原与 抗体的专一性识别与结合， 它利用抗体与抗原产生的凝集反应、 沉淀反应等对靶标病原菌 作出快速有效的诊断与鉴定。 已报道用于青枯菌检测的血清学方法， 包括酶联免疫吸附 (ELISA)、 免疫萤光(IF)、 荧光原位杂交(FISH)以及免疫试纸条(Immuno ‑strip)等。 美国阿 格迪(AgdiaR)公司商品化生产的ELISA试剂盒和免疫 试纸条在欧美一些国家已被用于室内 及田间青枯病疑似样品的初步筛查。 但此类方法的缺点在于价格昂贵， 检测灵敏度不高。 如 Agdia的检测试纸条每 个样品的检测成本约￥ 50， 检测灵敏度阈值 一般在100‑101cfu/mL。 [0004]环介导等 温扩增技术(loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP)是一种 新的等温扩增技术， 因其操作简单快速、 特异 性、 灵敏度高、 成本低等特点， 逐渐成为可以替 代传统PCR的新的核酸扩增检测技术。 它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物， 利用 Bst DNA聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增， 大量合成目的DNA的同时， 产生副产 物–白色焦磷酸镁沉淀。 由于扩增反应依赖于靶DNA的6个独立的区域， 因此特异性 非常高， 反应在等温条件下进行， 则不需要PCR仪等昂贵设备， 仅用水浴锅等能够维持稳定 恒温的设备即可完成， 检测成本大 大降低， 应用范围显著扩大， 可以在田间进行 快速检测。 [0005]由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered  regularly  interspaced  short  palindromic  repeats， CRISPR)和 CRISPR相关蛋白(CRISPR ‑associated  protein， Cas蛋 白)组成的CRISPR/Cas系统被认为是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种适应性免疫 系统， 以消灭外来的遗传物质。 CRISPR序列是一个特殊的DNA重复序列， 包含有高度保守的 长度约为21 ‑48bp的重复序列(repeats)和 26‑72bp的间隔序列(spacer)。 重复序列被不同 的间隔序列隔开， CRISPR通过间隔序列对靶基因进行识别。 Cas位于CRISPR位点附近， 是双 链DNA核酸酶家族的总称。 随着对CRISPR/Cas系统的作用机制和Cas蛋白功能的逐步揭示， CRISPR/Cas系统逐渐发展成为一种由引导RNA指引Cas核酸酶对靶基因进行特定核酸编辑 的技术。 CRISPR/Cas系统的工作原理是crRNA(CRISPR ‑derived RNA)通过碱基配对与 tracrRNA(tran s‑activating  RNA)结合形 成tracrRNA /crRNA复合物， 此复合物引导核 酸酶 如Cas9蛋白至与crRNA配对的靶序列位点处剪切双链DNA， 从而实现对基因组DNA序列进行说　明　书 1/10 页 3 CN 115216552 A 3