(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210744561.7 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 广州迈景基因医学 科技有限公司 地址 510220 广东省广州市国际生物岛螺 旋四路9号第一层C101- 3单元 (72)发明人 陈敬臣　高淞泽　蔡兴盛　李梦真　 邓泱泱　 (74)专利代理 机构 深圳市创富知识产权代理有 限公司 4 4367 专利代理师 梁嘉朗 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种在NGS建库过程中引入额外index的方 法 (57)摘要 本发明属于NGS测序技术领域， 具体涉及一 种在NGS建库过程中引入 额外index的方法。 本发 明公开的在NGS建库过程中引入额外index的方 法中， 在引物或接头中引入 额外的样本index,使 得在最终文库中index的数量大于2 个， 正常的双 端‑index文库中引入额外的index后， 多样本测 序的结果可用三个到四个index进行数据拆分， 可进一步降低多样本上机测序中的index   crosstalk问题， 从而降低超高深度测序中的潜 在read污染， 提高结果的灵敏度。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114990194 A 2022.09.02 CN 114990194 A 1.一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 其特征在于， 在NGS建库过程中， 在引 物或接头中引入额外的样 本index,使 得在最终文库中index的数量大于2个， 从而进一步降 低多重样本上机后read拆分时的i ndex crosstalk问题。 2.根据权利 要求1所述的一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 其特征在于， 所 述index为长度在4 ‑12bp的index序列。 3.根据权利 要求1所述的一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 其特征在于， 所 述NGS建库采用的方法包括多重PCR的建库方法和链接酶建库方法。 4.根据权利 要求3所述的一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 其特征在于， 采 用多重PCR建库方法进行NGS建库时， 所述index的引入位置在引物的中间位置； 采用链接酶 建库方法进行NGS建库时， 所述 index的引入位置在接 头序列的3 ’端。 5.根据权利 要求3所述的一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 其特征在于， 采 用链接酶建库方法进行NGS建库时， 用于链接的接头可以是Y ‑型接头， 也可以是发夹型接 头； 采用的链接方式可以是平末端链接， 也可以是T/A 链接。 6.根据权利 要求1所述的一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 其特征在于， 所 述NGS建库采用平台包括 Illumina测序平台、 i on torrent测序平台、 MGI测序平台。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990194 A 2一种在NGS建库过 程中引入额外inde x的方法 技术领域 [0001]本发明属于NGS测序技术领域， 具体涉及一种在NGS建库过程中引入额外index的 方法， 用以降低NGS测序中的i ndex crosstalk。 背景技术 [0002]下一代测序(Next  generation  sequencing， NGS)也称为深度测序 或大规模平行 测序， 可同时对数百万小片段进行测序。 NGS已广泛应用于众多领域， 其中最常用的是基因 组DNA变异分析和RNA表达分析。 这些分析应用可扩展到整个基因组和整个外显子组， 还可 专门测序特定区域和基因组合。 当前， 基于多重P CR的二代测序靶向技术的建库方法可以分 成2种： 1)使用成对的特异性引物进行常规PCR扩增对靶DNA区域进行捕获和富集； 其中 index可以包含在引物中， 在前2个PCR循环中被整合至扩增子。 2)使用单端 特异性引物进行 锚式PCR扩增 对靶DNA区域进行捕获和富集； 其中index可包含在通用引物 中。 除了基于PCR 的靶向建库方法外， 还有基于探针捕获的靶向建库。 在探针捕获前， 首先要进 行全基因组建 库。 建库方法一般采用链接方法： 首先对DNA片段用链接酶加上通用接头， 其中index可包含 在接头内， 然后使用特异性引物和通用引物进行靶DNA富 集。 [0003]索引串扰(Index  crosstalk)是NGS技术应用中多重样本测序的一个内部缺陷， 这 可能是由索引跳跃(Index  hopping)、 合成接头引物时的污染， 或者制备文库时的接头污染 引起的。 Index  crosstalk可导致来源于一个样本的read在进行read拆分时被错误的分配 到其它样本中。 如果这些reads含有突变， 被错误的分配后， 可能会导致无突变的阴性样本 被判为阳性， 导 致假阳性的产生， 影响了NGS技 术在分子诊断等方面的应用。 [0004]为了降低索引串扰的影响程度， 在过去的几年里， 多重样本测序时大多采用双索 引接头进行文库构建。 很多数据表明， 它确实可以有效地减少索引串扰引起不同样本间的 read污染， 但 不能将其消除。 因此， 有必要对NGS建库方法进 行改良， 进一步降低多重样 本测 序时的索引串扰。 发明内容 [0005]为了克服上述现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种在NGS建库过程中引入 额外index的方法， 该 方法可以降低多重测序期间索引串扰的影响。 [0006]为实现上述目的， 本发明是通过以下技 术方案来实现的： [0007]本发明提供一种在NGS建库过程中引入额外index的方法， 具体为： NGS建库过程 中， 在引物或接头中引入额外的样本index,使得在最终文库中index的数量大于2个， 从而 进一步降低多重样本上机后read拆分时的i ndex crosstalk问题。 [0008]本发明的核心在于： 在NGS文库构建时引入额外的索引， 即在二重索引的基础上引 入第三个甚至第四个索引， 从而 进一步减少由于索引串扰引起的样本间read污染。 [0009]优选地， 所述index为长度在4 ‑12bp的index序列。 额外index序列的设计只有符合 index选用的基本原则即可(Panu  S,Patrik  K,Peng M,et al.BARCOSEL:a  tool for 说　明　书 1/5 页 3 CN 114990194 A 3