(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210613347.8 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 锡林郭勒职业学院 地址 026000 内蒙古自治区锡林郭勒盟锡 林浩特市明安图街1 1号 申请人 锡林郭勒盟坤源生物科技有限公司 (72)发明人 郭梁　徐伟良　李凤忠　李春冬　 刘国强　罗建兴　 (74)专利代理 机构 成都方圆聿联专利代理事务 所(普通合伙) 51241 专利代理师 李鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测蒙古白丽蘑和双孢蘑菇真实 性的引物和探 针 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测蒙古白丽蘑和 双孢蘑菇真实性的引物和探针， 引物和探针序列 如下： 正向引物序列如SEQ  ID No.1所示； 反向引 物序列如SEQ  ID No.2所示； 蒙古白丽蘑探针序 列如SEQ ID No.3所示； 双孢蘑菇 探针序列如SEQ   ID No.4所示； 质控探针序列如SEQ  ID No.5所 示。 本发明的引物、 探针的特异性好、 灵敏度高， 可以实现蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检 测， 并且可以进行蒙古白丽蘑和双 孢蘑菇的定量 检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114854898 A 2022.08.05 CN 114854898 A 1.蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的引物和探针组合， 其特征在于， 引物和探 针序列如下： 正向引物序列如SEQ  ID No.1所示， 反向引物序列如SEQ  ID No.2所示， 蒙古白丽蘑探针序列如SEQ  ID No.3所示， 双孢蘑菇探针序列如SEQ  ID No.4所示， 质控探针序列如SEQ  ID No.5所示。 2.根据权利要求1所述的蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的引物和探针， 其特 征在于， 蒙古白丽蘑 探针、 双孢蘑菇探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团， 3'端修饰 有淬灭基团， 报告基团为FAM、 HEX、 ROX或CY5 中的任意一种， 淬灭基团为TAMRA、 MGB、 BHQ1或 BHQ2中任意 一种。 3.权利要求1或2中所述的引物和探针组合在蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇检测中的应用。 4.一种试剂盒， 含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。 5.蘑菇中蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的方法， 其特 征在于， 步骤如下： (1)提取蘑菇样品的DNA； (2)以步骤(1)的DNA为模板， 利用SEQ  ID No.1～SEQ  ID No.5的引物和探针进行多重 荧光定量P CR扩增， 以蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的阳性标准品做阳性对照， 以灭菌的去离子水 做阴性对照， 以DNA提取的空白对照做提取 方法的对照组； (3)Real‑time PCR反应结束后， 设置Threshold为自动， 读取蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇和 质控相应探针的Ct值以及阳性对照、 阴性对照和空白对照的Ct； 只有当质控Ct≤40和阳性 对照Ct≤40， 阴性对照和空白对照Ct 为0时才可以进行相应蘑菇探针结果的判定； 当相应探 针的Ct≤40， 结果判定为具有相应蘑菇源性， 同时有多个探针的Ct≤40， 结果判定为具有相 应两蘑菇源性； (4)利用蒙古白丽蘑和双孢蘑菇阳性标准品做DNA定量的标准曲线； (5)利用蘑菇中的相应蘑菇源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到蘑菇中相应蘑菇 源性的定量检测结果。 6.根据权利要求5所述的蘑菇中蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的方法， 其特 征在于， Real ‑time PCR扩增参数为： 预变性温度94℃， 30s， 变性温度94℃， 5s， 退火延伸温 度60℃， 31s， 40个 循环。 7.根据权利要求5所述的蘑菇中蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的方法， 其特 征在于， Real ‑time PCR反应体系为： Probe  qPCR预混液 10 μL、 SEQ  ID No.1所示的正向引物 1μL， 浓度为10 μmol/L； SEQ  ID No.2所示的反向引物1μL， 浓度为10 μmol/L； SEQ  ID No.3所 示的蒙古白丽蘑探针0.5 μL， 浓度为10 μmol/L； 、 SEQ  ID No.4所示的双 孢蘑菇探针0.5 μL， 浓 度为10 μmol/L和SEQ  ID No.5所示的质控探针0.5 μL， 浓度为10 μmol/L； DNA模板2 μL， 灭菌的 去离子水4.5 μL， 总体积20 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854898 A 2一种同时检测蒙古白丽蘑和双孢蘑菇真实性的引物和探针 技术领域 [0001]本发明属于食品检测技 术领域， 尤其涉及食用菌中蘑菇检测领域。 背景技术 [0002]蒙古白丽蘑性平、 味甘、 有宣肠益气、 散热、 解表的效用。 因其子实体大， 菌 肉紧实 而肥厚， 质地鲜嫩， 具有独特香味， 是远近闻名的野生食用菌。 蒙古白丽蘑的名贵之处在其 具有的香鲜味道， 其含有大量香脂类挥发性物质及谷氨酸钠、 白丽蘑氨酸、 5 ’ ‑鸟甘醇等鲜 味物质与增鲜物质， 其香鲜味回味无穷， 远远就能闻到。 蒙古白丽蘑不但营养价值高， 而且 富含多糖、 多肽、 多不饱和脂肪酸、 人体必需的8种氨基酸以及多种维生素和铁、 钙、 磷、 硒等 矿物质， 具有抗氧化、 抗衰 老、 抗肿瘤、 降血压、 血脂、 血糖等医疗保健作用， 可治疗燥热不安 等症状。 其氨基酸成分可与动物食物中氨基酸 成分平衡， 在人体内具有 更好的吸收作用， 调 节人体的机能， 增强身体的免疫 能力， 适用于消化不良， 腹部胀痛， 胃痛。 也可降低血压， 治 疗软骨症， 还具有一定的抗癌作用。 具有杀菌作用， 蒙古族有用白丽蘑作药的记载， 治疗外 伤、 解毒等民间流传方法。 其属于低热量食品， 非常适用于减肥及健身人群。 由于人为因素 和气候因素的影响， 使 得蒙古白丽蘑种群数量减少， 蒙古白丽蘑的质量和产量每况愈下， 难 以满足商品化、 市场化的要求， 导致蒙古白丽蘑价格上涨。 由于其价格的昂贵和特有 珍稀价 值高， 市场上常出现冒充伪 劣产品和其他种类野生菌混淆 的现象。 而商家经常以一些来源 广泛、 容易 获取的蘑菇充当蒙古白丽蘑进 行销售。 例如， 杏鲍菇、 秀珍菇、 双孢蘑菇 等商用食 用菌常被用来制作白丽蘑 蘑菇酱。 [0003]我国对于食用菌真伪鉴别技术方面的研究起步晚， 这一领域的研究还处于初 步阶 段。 由此可见， 当前在食用菌真伪鉴别技术方面的研究领域， 实现具有我国自主产权的、 安 全高效的检测技术是一个充满机遇同时极具挑战的研究课题。 作为蒙古白丽蘑产地的锡林 郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的相关蘑菇真伪鉴别技 术及检测标准， 以此保护地方特色蘑菇和维护消费者的合法权益。 目前， 蘑菇真伪鉴别相关 的技术研究、 检测标准、 发明专利以及商业试剂盒主要集中在普通PCR  ITS的技术， 实时荧 光PCR直接检测和多通道同管质控检测报道较少。 假阴性也是困扰P CR技术在蘑菇真伪鉴别 中广泛应用的瓶颈 。 同管质控是去除假阴性的有效手段。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题为： 如何提供一种高效且特异性强的蘑菇中蒙古白丽 蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的引物和探针， 解决蘑菇中蒙古白丽蘑和双孢蘑菇源性成 分定性和定量检测问题。 [0005]本发明的技术方案为： 蒙古白丽蘑、 双孢蘑菇以及质控同管检测的引 物和探针组 合， 引物和探针序列如下： [0006]正向引物序列如SEQ  ID No.1所示； [0007]反向引物序列如SEQ  ID No.2所示；说　明　书 1/7 页 3 CN 114854898 A 3