(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210741012.4 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 深圳市爱医生物科技有限公司 地址 518038 广东省深圳市宝安区西乡街 道铁岗社区桃花源智创小镇B2栋4层 申请人 深圳市易瑞生物技 术股份有限公司 (72)发明人 莫秋华　王炳志　杨波　严义勇　 付辉　周巧妮　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 肖云 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/558(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测旋毛虫和刚地弓形虫的引物 组合、 试剂盒及方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测旋毛虫和刚地 弓形虫的引物组合、 试剂盒及方法与应用。 所述 引物组合包括用于检测旋毛虫的第一引物组和 用于检测刚地弓形虫的第二引物组， 所述第一引 物组包括如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:6所示的序 列， 所述第二引物组包 括如SEQ ID NO:7‑SEQ ID  NO:12所示的序列， 本发明的引物组合能够用于 猪肉、 乳制品、 蛋类等动物源性食品中上述2种重 要寄生虫的现场快速检测， 且灵敏度高， 特异性 好。 权利要求书2页 说明书10页 序列表3页 附图2页 CN 114990245 A 2022.09.02 CN 114990245 A 1.一种同时检测旋毛虫和刚地弓形虫的引物组合， 其特征在于， 所述引物组合包括用 于检测旋毛虫的第一引物组和用于检测刚地弓形 虫的第二引物组； 其中， 所述第一引物组包括如序列SEQ  ID NO:1所示的正向内引物FIP ‑1、 如序列SEQ   ID NO:2所示的反 向内引物BIP ‑1、 如序列SEQ  ID NO:3所示的正向外引物F3 ‑1、 如序列SEQ   ID NO:4所示的反向外引物B3 ‑1、 以及如序列SEQ  ID NO:5所示的正向环引物LF ‑1和如序列 SEQ ID NO:6所示的反向环引物LB ‑1； 所述第二引物组包括如序列SEQ  ID NO:7所示的正向内引物FIP ‑2、 如序列SEQ  ID NO: 8所示的反向内引物BIP ‑2、 如序列SEQ  ID NO:9所示的正向外引物F3 ‑2、 如序列SEQ  ID NO: 10所示的反向外引物B3 ‑2、 以及如序列SEQ  ID NO:11所示的正向环引物LF ‑2和如序列SEQ   ID NO:12所示的反向环引物LB ‑2。 2.根据权利要求1的引物组合， 其特征在于， 还包括采用生物素、 地高辛或荧光素对所 述引物组合中的环引物进行标记， 得到的带标记的正向环引物FITC ‑LF‑1、 FITC‑LF‑2和带 标记的反向环引物Bi o‑LB‑1、 Dig‑LB‑2。 3.根据权利要求2的引物 组合， 其特征在于， 引物 组合在每25 μL反应体系中的使用浓度 为： 正向内引物FIP ‑1、 FIP‑2， 反向内引物BIP ‑1、 BIP‑2的终浓度均为0.8 ‑2.0 μmol/L； 正向 外引物F3 ‑1、 F3‑2， 反向外引物B3 ‑1、 B3‑2的终浓度均为0.1 ‑0.3 μmol/L； 正向环引物LF ‑1、 LF‑2， 反向环引物LB ‑1、 LB‑2的终浓度均为0.2 ‑0.5 μmol/L； 带标记的正向环引物FITC ‑LF‑ 1、 FITC‑LF‑2， 带标记的反向环引物Bi o‑LB‑1、 Dig‑LB‑2的浓度均为0.2 ‑0.5 μmol/L。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1 ‑3任一项所述的引物组合。 5.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括核酸检测试纸。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述核酸检测试纸为LFD检测试纸； 优选 地， 所述LFD检测试纸 为纳米胶体金核酸检测试纸。 7.权利要求1 ‑3任一项所述的引物组合或权利要求4 ‑6任一项所述的试剂盒在制备旋 毛虫和刚地弓形 虫检测产品中的应用。 8.根据权利要求7 所述的应用， 其特 征在于， 检测包括以下步骤： (1)配置双重LAMP反应体系： 按终浓度计算， 浓度为1 ‑2mM的dNTPs、 6～10U的Bst   2.0DNA聚合酶、 15 ‑25mM的Tris ‑HCl、 5‑10mM的MgSO4、 0.2‑0.3mg/mL的BSA、 0.6 ‑1M的DMSO、 8‑12mM的(NH4)2SO4、 15‑25mM的KCl、 0.05 ‑0.15％的Tween‑20和0.6‑1M甜菜碱； 正向内引物 FIP‑1、 FIP‑2， 反向内引物BIP ‑1、 BIP‑2的浓度均为0.8 ‑2.0 μmol/L； 正向外引物F3 ‑1、 F3‑2， 反向外引物B3 ‑1、 B3‑2的浓度均为0.1 ‑0.3 μmol/L； 正向环引物LF ‑1、 LF‑2， 反向环引物LB ‑ 1、 LB‑2的浓度均为0.2 ‑0.5 μmol/L； 带标记的正向环引物FITC ‑LF‑1、 FITC‑LF‑2， 带标记的 反向环引物Bio ‑LB‑1、 Dig‑LB‑2的浓度均为0.2 ‑0.5μmol/L； 待测样品DNA的加入量为10 ‑ 1000pg； RNase ‑free water将反应 体系的总体积补足至25 μL； (2)反应： 将步骤(1)中的反应体系进行恒温反应， 然后将反应后的产物用核酸检测试 纸进行检测， 5 ‑10min后读取检测结果。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 步骤(2)中检测结果的判读为： 阴性： 当核酸检测试纸在质控线C线出现一条红色条带； 在检测线未出现红色条带， 则 表明待检样品未检测到 旋毛虫和刚地弓形 虫的基因 组DNA； 阳性： 当核酸检测试纸在质控线C线出现一条红色条带； 在检测线出现红色条带， 则表权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990245 A 2明待测样品检测到 了旋毛虫和/或刚地弓形 虫的基因 组DNA； 无效： 当核酸检测试纸质控线C线未 出现条带时， 则表明检测过程无效。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述步骤(2)中的恒温反应的温度为60 ‑ 65℃， 恒温反应的时间为20 ‑50min。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990245 A 3