(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210792539.X (22)申请日 2022.07.05 (71)申请人 长江大学 地址 434000 湖北省荆州市南环路1号 (72)发明人 张付贤　雷连成　广敏　彭康尧　 靳洪振　吴亚鑫　 (74)专利代理 机构 安徽宏铎知识产权代理事务 所(普通合伙) 3425 0 专利代理师 许凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/21(2006.01) (54)发明名称 一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种副猪嗜血杆菌的即时可 视化检测方法， 属于传染病检测领域， 为了克服 现有副猪嗜血杆菌检测方法的不足,本发明提供 一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方法， 其是 运用环介导等温扩增方法同时联合横向流动试 纸条检测副猪嗜血杆菌,建立环介导等温扩增技 术与横向流动试纸条法方法检测副猪嗜血杆菌， 采用环介导等温扩增与横向流动试纸条相互结 合的技术， 使LAMP扩增产物的检测可视化， 检测 结果明显直观， 并具有高特异性、 高灵敏度、 操作 简单的特点， 适用于 基层和现场使用。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115029460 A 2022.09.09 CN 115029460 A 1.一种副猪嗜血 杆菌的即时可视化检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法如下： HPS基因组提取： 按照天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取 HPS基因组， 置于‑20℃保存备用； 环介导等温扩增反应： 将提取的HPS基因组当作模板在扩增反应体系中进行环介导等 温扩增反应,扩增反应体系中包括10x  ThermoPol  Buffer 2.5μL,MgS04(1OOmM)1.5μL, dNTP Mix(10mM)3.5 μL， 内引物FIP、 BIP(10mM)4 μL,外引物F3、 B3(10mM)0.5 μL， Bst  DNA聚合 酶1μL， 甜菜碱2 μL,模板2 μL,ddH2O补足至25 μL； 其中外引物F3序列如SEQ.No1所示、 外引物 B3序列如SEQ.No2所示,内引 物FIP的序列如SEQ.No3所示， 内引物BIP的序列如SEQ.No4所 示， 分别在内引物FIP5'端进行生物素(Biotin)标记,在BIP  5'端进行6 ‑FAM标记， 其引物序 列为： LFD检测： 使用标记的引物进行环介导等温扩增反应， 在66℃下扩增30min； 反应结束后 取5 μL反应产物加入到95 μL  DEPC水溶液中， 混匀， 将横向检测试纸条检测端垂直插入待测 液中， 静置 5min,肉眼观察结果。 2.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方法， 其特征在于： 所述 环介导等温扩增反应体系置于温度66℃， 30min进行扩增后， 取5μL反应产物加入到 95uLDEPC水溶液中， 混匀， 将横向检测试纸条检测 端垂直插入待测液中， 静置5min,判断试 验结果； 所述横向流动试纸条,采用层析式双抗夹心法检测核酸扩增产 物； 该检测方法的检 出限以副猪嗜血 杆菌基因 组DNA为模板,可检测到128.5 ×10‑10ng/ μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029460 A 2一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方法， 特别是涉及一种运用环介 导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条法(LFD)结合的方法即时检测副猪嗜血杆菌的检 测方法， 属于传染病检测领域。 背景技术 [0002]副猪嗜血杆菌(Haemophilus  parasuis,Hps)是猪上呼吸道 中常在的一种机会致 病菌,在特定条件下能够侵入机体， 引发以全身性疾病。 HPS的感染对仔猪和 青年猪的健康 造成严重危害， 感染猪以猪多发性纤维素性浆膜炎、 关节炎和浆膜炎为特征。 规模化养殖模 式使养殖密度增加， 病毒性疾病的流行加重了副猪嗜血杆菌的继发感染， 导致仔猪死淘率 增加、 育肥猪生长性能下降， 成为患病猪群的重要继发病原之一。 因此， 建立快速准确的诊 断方法， 及时采取相应的防治措施是控制副猪嗜血 杆菌感染的关键 。 [0003]现有技术中检测副猪嗜血杆菌的方法主要有： 涂片镜检法、 培养基分离鉴定法、 免 疫学检测方法及包括巢式PCR、 实时荧光定量PCR等多种PCR技术。 环介导等温扩增(loop ‑ mediated  isothermal amplification， LA MP)技术是日本 学者Noti mi于2000年发明的一种 适用于病原学诊断的恒温扩增技术， 该方法利用4条特异 性引物识别靶DNA中的6个片段， 结 合具有链置换特性的Bst  DNA聚合酶， 在恒定温度下即可完成靶DNA的特异性扩增。 与其他 检测技术相比， LAMP检测方法具有简便、 快速、 灵敏和特异性高等特点。 目前用来判断LAMP 扩增结果的方法主要有： 焦 磷酸镁沉淀法、 染料法、 实时荧光定量法、 实时浊度法， 前两种判 断方式会因为结果不明显而造成肉 眼观察不便捷及误判等， 而后两种需要昂贵的的实验室 设备， 也无法完成即时检测。 因此建立一种简单快速、 准确有效的副猪嗜血杆菌可视化诊断 方法显得 尤为重要。 [0004]因此， 本发明建立了一种副猪嗜血杆菌 的即时可视化检测方法， 为副猪嗜血杆菌 的检测及调查分析提供了一种新的简便、 快捷的途径。 发明内容 [0005]本发明的主要目的是为了提供一套用于快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩 增横向流动试纸条引物组,由副猪嗜血杆菌infB基因环介导等温扩增横向流动试纸条引物 组构成,可用于检测副猪嗜血 杆菌的环介导 等温扩增横向流动试纸条反应。 [0006]本发明的目的可以通过采用如下技 术方案达到： [0007]一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方法， 包括HPS基因组提取： 按照天根生化科 技有限公司细菌基因 组DNA提取 试剂盒说明书提取HP S基因组， 置于‑20℃保存备用； [0008]环介导等温扩增 反应： 将提取的HPS基因组当作模板在扩增反应体系中进行环介 导等温扩增反应,扩增反应体系中包括10x  ThermoPol  Buffer 2.5,MgS04(1OOmM)1.5 μL, dNTP Mix(10mM)3.5 μL， 内引物FIP、 BIP(10mM)4 μL,外引物F3、 B3(10mM)0.5 μL， Bst  DNA聚合 酶1μL， 甜菜碱2 μL,模板2 μL,ddH2O补足至25 μL； 其中外引物F3序列如SEQ.No1所示、 外引物说　明　书 1/4 页 3 CN 115029460 A 3