(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210599372.5 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 中国计量大 学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区 学源街258号 (72)发明人 申屠旭萍 　宋阳　刘妍　俞晓平　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 郑海峰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭 白菊黑斑病菌的方法 (57)摘要 本发明提供了一种利用CRISPR/Cas12a体系 可视化检测杭白菊黑斑病菌Alternaria   alternata的方法， 包括如下步骤： 借助PCR技术 对杭白菊黑斑病菌Alt特异性基因片段进行扩 增； 在crRNA的介导下， Cas12a可特异性识别扩增 产物， 并激活核酸酶活性， 从而切割两端修饰有 FAM和BHQ1的任 意碱基序列ssDNA(Reporter)， 形 成FAM‑ssDNA片段与BHQ1 ‑ssDNA片段； FAM ‑ssDNA 和BHQ1‑ssDNA能在蓝光透射仪的照射下展现出 荧光， 由此 实现对于杭白菊黑斑病菌Alt的检测。 该方法操作简单便携， 不依赖大型仪器设备， 成 本低廉， 且灵敏度高、 特异性强， 具有一定的应用 前景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 114908187 A 2022.08.16 CN 114908187 A 1.利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌Alternaria  alternata的方 法， 其特征在于包括如下步骤： 步骤一： 对杭白菊黑斑病菌A.alternata基因组中的特异性目的基因片段进行PCR扩 增； PCR扩增所用引物序列包括： Alt‑PCR‑F， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示； Alt‑PCR‑R， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示； 步骤二： 将扩增的PCR产物加入含CRISPR/Cas体系的反应管中， 孵育， 所述的CRISPR/ Cas体系包括针对目的基因的特异性crRNA、 CRISPR/Cas12a蛋 白和用于酶标仪荧光检测的 reporter序列； crRNA的序列如SEQ  ID No.3所示； 在crRNA的介导下， CRISPR/Cas12a蛋白特 异性识别特异性基因片段的扩增片段， 并激活核酸酶活性， 从而切割两端修饰有 FAM和BHQ1 的reporter序列， 形成FAM ‑ssDNA与BHQ1 ‑ssDNA； 步骤三： FAM ‑ssDNA与BHQ1 ‑ssDNA在蓝光投射仪下显现出荧光， 实现对于杭白菊黑斑病 菌Alternaria  alternata的可视化检测。 2.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌 Alternaria  alternata的方法， 其特征在于： 步骤一中， PCR程序为： 95℃预变性3min； 95℃ 30s， 55℃30s， 72℃3 0s， 共循环3 0次； 后72℃延伸10mi n。 3.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌 Alternaria  alternata的方法， 其特征在于： 步骤二中， 孵育温度为37℃， 孵育时间为 30min。 4.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌 Alternaria  alternata的方法， 其特征在于： 所述reporter序列为用于酶标仪荧光检测的 ssDNA FQ reporter， 其序列如下： 5 ’ ‑FAM‑NNNNN‑BHQ1‑3’， NNNNN指任意碱基序列。 5.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌 Alternaria  alternata的方法， 其特征在于： 步骤二中， Cas12a浓度为100nM， Cas12a与 crRNA的浓度比为1:1 ‑1:5， Repor ter序列的浓度为25 0‑2000nM。 6.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌 Alternaria  alternata的方法， 其特征在于： 步骤二中， CRISPR/C as12a体系的反应温度为 35‑40℃， 反应时间为10 ‑90min。 7.如权利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊黑斑病菌 Alternaria  alternata的方法， 其特 征在于： 步骤三中， 反应管直接于蓝光透射仪的照射下展现出荧光， 实现对于杭白菊黑斑病菌 的可视化检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908187 A 2一种利用CRI SPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊 黑斑病菌的 方法 技术领域 [0001]本发明属于生物与化学领域， 涉及一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白 菊黑斑病菌Alternaria  alternata(A.alternata， Alt)的方法。 背景技术 [0002]规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR,Clustered  regularly  interspaced   shortpalindromic  repeats)是许多细菌和古细菌 中的一种应对入侵的免疫机制。 CRISP R 及CRISPR相关蛋白(CRISPR  associated  proteins,Cas)被称为CRISPR/Cas系统。 Cas12a为 第2类V型Cas蛋白， 它在未激活时无切割活性， 当其与特定的crRNA结合后， Cas12a构象将发 生改变， 与crRNA结合形成Cas12a ‑crRNA二元复合物。 该复合物能特异性得识别靶 标DNA， 并 激活其核酸内切酶活性。 当Cas12a依次对DNA双链进行顺式切割后， 该活性位点将持续暴 露， 展现出反式切割活性， 对周围的ssDNA进行非特异性切割。 针对Cas12a的特性， 科学家们 设计了多种高灵敏度、 高特异性的核酸检测平台。 [0003]杭白菊(Chrysanthemum  morifolium  Ramat)为菊科菊属， 是我国传统的药用栽培 植物和浙江省八大药材 “浙八味”之一。 目前浙江杭白菊 常年种植面积7万亩， 年均总 产值超 过1亿元， 约占全国菊花总销量的50％。 现代药理研究表明其具有消炎、 抗氧化、 抗癌， 舒血 管、 降血脂、 改善肠道微环境等多种功效。 而黑斑病 是田间作物的主要病害， 侵染发生在潮 湿季节， 出现圆形或不规则形黑色叶斑， 其危害主要发生在叶片上。 有时发生在叶柄、 茎和 花部。 在农作物田间染病率为40％左右， 严重时可达70％以上。 黑斑病的产生严重影响了农 产品的经济效益。 然而， 传统的分离鉴定法检验周期 较长， 操作步骤繁复， 耗时费力， 难以满 足田间的便捷检测的需求， 因此， 克服传统分离鉴定方法的局限， 引入前沿技术， 开发出准 确、 快速、 便捷、 灵敏、 特异的黑斑病菌Alternaria  alternata检测技 术具有重大意 义。 [0004]现阶段杭白菊黑斑病菌Alt的检测技术主要依赖形态学与分子生物学或免疫学检 测相结合的方法。 形态学鉴定需要在患病植株上经过平板培养法获得病原菌， 随后通过显 微镜对病原菌进行形态学鉴定， 大概周期为7 ‑10天。 分子生物学依靠16s  RNA进行鉴定， 来 对目的基因进行扩增， 再进行测序后通过序列比对确定黑斑病菌A.alternata， 由于需要 PCR扩增和测序， 所需时间为3 ‑5天。 同时这两种检测方法对仪器和检测人员的技术要求较 高， 难以实现现场即时检测； 免疫学依靠如免疫标记与菌丝尖端和与新生菌丝相关的无定 形物质相结合， 通过检测信号达到对该病原菌检测的目的， 此类检测方法检测虽然特异性 好， 但灵敏度较低， 耗时较长， 成本较高， 因此并不 适用于基层大批量检测。 发明内容 [0005]本发明的目的在于克服传统杭白菊黑斑病菌A.alternata检测的技术缺陷， 以特 异性基因片段为检测目标， 提供一种简单、 快速、 灵敏、 特异、 便携的检测方法。 [0006]为此， 本发明采用的技 术方案如下：说　明　书 1/4 页 3 CN 114908187 A 3