(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210628836.0 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 四川儒愿生物科技有限公司 地址 610000 四川省成 都市高新区府 城大 道西段39 9号7栋2单 元10楼10 02号 (72)发明人 陶向　唐雪　李洪浩　雍彬　 黄维藻　 (74)专利代理 机构 成都为知盾专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 51267 专利代理师 杨宜付 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种分子标记引物及马铃薯晚疫病检测方 法 (57)摘要 本发明公开一种分子标记引物及马铃薯晚 疫病鉴定方法， 分子标记引物用于鉴定马铃薯晚 疫病致病疫霉， 所述分子标记如序列表SEQ  ID  NO： 1～6所示。 鉴定 方法包括如下步骤： 提取待测 材料组织DNA； 使用所示 分子标记引物进行PCR扩 增； PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检 测。 本发明提供的三对引物仅在致病疫霉DNA为 模板时能获得阳性扩增条带， 扩增产物经测序分 析与预期序列的相似度分别为94 .96％、 97.71％、 96.44％， 而在以辣椒疫霉等近缘种的 基因组DNA为模板时均无克隆条带， 引物特异性 好， 能有效区分近缘种。 本发明方法可 以检测到 没有任何病斑、 但是已经染菌的叶片， 这对病害 防控相当重要。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图3页 CN 115198028 A 2022.10.18 CN 115198028 A 1.一种用于检测马铃薯晚疫病的分子标记引物， 其特征在于， 所述分子标记为下列引 物对中的一对或多对： 第一引物对： 第一上游引物PiF1： 5' ‑GCTACCAACATCTTCCACAATCT‑3'； 第一下游引物PiR 1： 5'‑TCTCTAAAACCTCTGAGC CCCT‑3'； 第二引物对： 第二上游引物PiF2： 5' ‑CTGAAAATGGACGGGGATAGCGA ‑3'； 第二下游引物PiR2： 5' ‑TGCGATGTGAGCGATG GCAAATG‑3'； 第三引物对： 第三上游引物PiF3： 5' ‑ATGGACGGGGATAGCGACTCT TA‑3'； 第三下游引物PiR3： 5' ‑GATGCCCTTGCTGACTCAC CTG‑3'。 2.一种马铃薯晚疫病的检测方法， 其特征在于， 适用权利要求1所述分子标记引物， 包 括如下步骤： a)提取待测材 料组织DNA； b)以步骤a)提取得到的DNA为模板， 使用所示分子标记引物进行PCR扩增， 扩增程序 为： 94℃预变性3min； 94℃变性30s， 59.3℃退火30s， 72℃延伸1min， 共30个循环； 最后72℃延伸 8min； c)PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。 3.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的总体系为20 μL： 无菌ddH2O7 μL、 10 μM上游引物1 μL、 10 μM下游引物1 μL、 2 ×Easy Taq PCR Super Mix酶10 μL、 模板DNA  1 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115198028 A 2一种分子标记引物及马铃薯晚疫病检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于马铃薯晚疫病基因检测领域， 涉及检测马铃薯晚疫病的分子标记引 物， 以及使用该分子标记引物在马铃薯晚疫病检测方法中的应用。 背景技术 [0002]马铃薯的全球种植面积和总产量仅次于水稻、 小麦和玉米， 是全球第四大作物。 我 国是全球最大的马铃薯生产国， 将马铃薯列为水稻、 小麦、 玉米之后的第四大主粮。 马铃薯 生产实践中多采用块茎繁殖， 但这种 营养繁殖方式易造成病原菌代代相传 并不断积累， 其 中尤以马铃薯晚疫病最为严重。 马铃薯晚疫病是一种在 全世界绝大多 数马铃薯种植区流行 的毁灭性病害， 是马铃薯最具毁灭性的病害， 在马铃薯整个生育期内， 只要条件适宜， 其病 原菌——致病疫霉Phytophthora  infestans即可快速产生大量游动孢子， 并在短时间内完 成数代循环侵染， 导致30 ‑60％的产量损失， 甚至绝收。 时至今日， 马铃薯晚疫病每年造成的 经济损失依然超过6 0亿美元， 如何有效防控该病害仍是全球面临的共同问题。 [0003]传统的晚疫病检测方法包括观察发病症状和分离病原物进行形态学鉴定两种。 然 而直接观察容易遗漏发病初期的植物材料， 且致病疫霉引发的病害易与Pythiumspp.， Fusariumspp.  和Rhizoctoniaspp.引起的病害症状混淆。 因此， 分离得到致病疫霉菌是非 常有必要的。 但致病疫霉的分离纯培养有较高的技术要求， 且可用于病菌鉴定的形态学特 征很少， 鉴定起 来也比较困难。 [0004]分子检测的出现为植物病害的快速、 准确诊断提供了新的思路和方法。 近年来基 于PCR 技术的植物病害分子检测技 术在植物病害防治中起着越来越重要的作用。 [0005]在实现本发明过程中， 发明人发现现有技术中至少存在如下技术问题中的一个问 题： [0006]基于转录间隔区(ITS)、 线粒体基因Cox1 ‑Cox2等靶标的分子检测技术受限于序列 差异小、 GC含量高等原因， 难以将靶标疫霉菌与其近缘种区分开或不 适宜于用作分子靶标。 [0007]现有技术中公开了以致病疫霉Ypt1序列为分子靶标， 设计了2对引物对11种不同 疫霉菌进行检测， 结果显示1 1种疫霉菌均有扩增条 带， 引物特异性较低。 [0008]现有技术还公开了以致病疫霉核糖体DNA转录间隔区(Internal  Transcribed   Spacer， ITS)  ITS‑1为检测靶标开发了一套分子检测技术体系， 但该检测 靶标不能区分近 缘种芋疫霉  (Phytophthora  colocasiae)、 恶疫霉(Phytophthora  cactorum)和棕榈疫霉 (Phytophthora palmivora)。 [0009]线粒体基因Cox1 ‑Cox2通常GC含量较高， 而Lpv基因又少有研究， 只针对部分疫霉 菌可以进行有效检测， 不 适用于致病疫霉菌的检测。 [0010]病害分子检测体系的建立， 关键在于使用合 适的分子靶标。 [0011]因此， 发掘新的分子检测靶标， 对于完善致病疫霉分子精准检测体系及提高我国 马铃薯晚疫病 病害管理水平具有重要意 义。说　明　书 1/9 页 3 CN 115198028 A 3