(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210652329.0 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 乐山师范学院 地址 614000 四川省乐 山市中区滨河路7 78 号 (72)发明人 史铠　易志刚　宋九华　 (74)专利代理 机构 成都玖和知识产权代理事务 所(普通合伙) 51238 专利代理师 胡琳梅 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/70(2006.01)C12N 15/113(2010.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种免PAM序列的DNA分子机器用于检测新 冠病毒的方法和应用 (57)摘要 本发明属于分子诊断技术领域， 具体为一种 免PAM序列的DNA分子机器。 基于该DNA分子机器 与CRISPR ‑Cas12a耦合构建了一个名为PfTSDR ‑ CRISPR检测SARS ‑CoV‑2的方法及其应用， 所述 DNA分子机器的制备方法包 括将DNA1/DNA2 /DNA3 探针、 SARS ‑CoV‑2的RdRp基因与燃料探针经级联 toehold介导的链置换反应(TSDR)获得， 所述检 测SARS‑CoV‑2的方法包括将DNA分子机器与 CRISPR‑Cas12a耦合实现。 本发明避免了对多酶、 复合引物和PAM设计的需要， 本发明还实现了对 食品包装和水果表面SARS ‑CoV‑2的检测， 为 COVID‑19的诊断提供了一种很有前 景的方法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 115058416 A 2022.09.16 CN 115058416 A 1.一种免PAM序列的DNA分子机器， 其特征在于， 所述DNA分子机器的制备方法包括将 DNA1/DNA2/DNA3探针、 SARS ‑CoV‑2的RdRp基因与燃料探针经级联toehold介导的链置换反 应(TSDR)获得； 所述DNA1/DNA2/DNA3探针为DNA1、 DNA2和DNA3形成的探针， 序列分别如SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示； 所述燃料探针的序列如SEQ  ID NO.5所示。 2.根据权利要求1所述的DNA分子机器， 其特征在于， 所述DNA1/DNA2/DNA3探针 的制备 方法包括： 将DNA1、 DNA 2和DNA 3的混合物在95℃下 退火5分钟， 并缓慢冷却获得。 3.根据权利要求1所述的DNA分子机器， 其特征在于， 所述级联TSDR使用的缓冲液为 Tris‑HCl、 PBS或H EPES缓冲液。 4.根据权利要求1所述的DNA分子机器， 其特征在于， 所述级联TSDR使用了不同浓度的 所述SARS ‑CoV‑2的RdRp基因， 所述SARS ‑CoV‑2的RdRp基因的浓度范围为10 0aM‑10pM。 5.根据权利要求1所述的DNA分子机器， 其特征在于， 所述DNA1、 DNA2和DNA3探针的摩尔 比为1： 1‑1.5： 1‑2。 6.一种检测SARS ‑CoV‑2的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 将权利要求1 ‑5任一项所 述的一种免PAM序列的DNA分子机器与CRISP R‑Cas12a系统耦合， 检测SARS ‑CoV‑2的RdRp基 因。 7.根据权利要求6所述的一种检测SARS ‑CoV‑2的方法， 其特征在于， 所述DNA分子机器 与CRISPR‑Cas12a系统耦合后， 还和等温信号 放大相结合。 8.根据权利要求6所述的一种检测SARS ‑CoV‑2的方法， 其特征在于， 所述CRISPR ‑ Cas12a系统包括C as12a‑gRNA复合物， 所述C as12a‑gRNA复合物的制备方法包括： 将C as12a 与gRNA孵 育获得； 所述gRNA的序列如SEQ  ID NO.6所示。 9.根据权利要求6所述的一种检测SARS ‑CoV‑2的方法， 其特征在于， 所述CRISPR ‑ Cas12a系统包括MCH/探针/AuE， 所述MCH/探针/AuE的制备方法包括： 将AuE与亚甲基蓝修饰 的发夹DNA共同孵育， 再浸入MCH中获得； 所述发夹DNA的序列如下： SH ‑(CH2)6‑TCAGCGTTCC TTTACCATTTTTTTAACTTATTTGGTTTTTTTTTT‑MB。 10.权利要求1 ‑5任一项所述的一种免PAM序列的DNA分子机器或权利要求6 ‑9任一项所 述的一种检测SARS ‑CoV‑2的方法用于检测SARS ‑CoV‑2的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058416 A 2一种免PAM序列的DNA分子机 器用于检测新冠病毒 的方法和 应用 技术领域 [0001]本发明属于分子诊断技术领域， 具体为一种免PAM序列的D NA分子机器。 基于该D NA  分子机器与CRISPR ‑Cas12a耦 合构建了一个名为PfTSDR ‑CRISPR检测SARS ‑CoV‑2的方法 及 其应用。 背景技术 [0002]急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS ‑CoV‑2)已经开发出对应的疫苗， 但鉴于疫苗的 有效 性和SARS ‑COV‑2的快速突变， 例如： Omicron/Delta/Alpha。 目前对SARS ‑COV‑2进行特 异 和敏感的早期检测仍然是控制C OVID‑19传播和监测治疗的有效方法。 因此， 开发特异且 灵 敏的SARS ‑CoV‑2检测方法具有十分重要的意 义。 [0003]与抗体和抗原检测相比， 核酸检测灵敏度高， 不易引起假阴性诊断。 因此， 核酸检 测可 以为COVID ‑19的诊断提供更有效的信息。 检测SARS ‑CoV‑2靶标基因组的金标准方法 称为 实时逆转录聚合酶链反应(qRT ‑PCR)， 它直接量化SARS ‑CoV‑2靶标基因组。 然而， qRT   PCR 需要热循环、 复杂的方案和昂贵的仪器， 不适用于小 型诊所或社区卫生设施。 成簇规律 间隔 短回文重复序列(clustered  regulatory  interspaced  short palindromic   repeats， CRISPR)及其有关  的功能蛋白质(CRISPR ‑associatedprotein， Cas蛋白)被称为 CRISPR‑Cas系统。 近年来， 该  系统在构建等温核酸诊断系统方面引发了一场技术革命。 在 这些核酸诊断系统中， 大多数依  赖于蛋白质的反式切割活性， 例如SHERLOCK(Cas13a)、 DETECTR(Cas12a)和  Cas14‑DETECTR(Cas14)等。 CRISPR ‑Cas12a系统能够 特异性切割双链 DNA(dsDNA)底  物或单链DNA(ssDNA)底物， 然后 在导向RNA(gRNA)的帮助下反式切割任何单 链DNA (ssDNA)。 由于被双链DNA底物激活的Cas12a具有比单链DNA底物更有效的反式切割 活 性， 大多数研究人员使用dsDNA作为激活底物。 为了避免dsDNA底物对PAM序列的依赖   性， 湖南大学聂舟课题组报告了一种免PAM序列的CRISPR ‑Cas12a系统， 其主要将作为   dsDNA底物设计具有气泡结构， 同时该气泡结构位于CRISPR ‑Cas12a系统识别的种 子区。 然  而， 该方法能否应用于电化学生物传感器， 并与等温信号放大相结合， 构建一个高灵敏度的   检测系统仍有 待探索。 [0004]DNA分子机器是当双链中较短的单链DNA或RNA在一个未配对区域(toehold)的协   助下被侵入时， 就会发生toehold介导的链置换反应(TSDR)。 通过设计级 联的TSDR， 能够  在 不使用任何酶的情况下实现靶循环扩增， 避免了复杂的引物设计、 严格的实验条件和高成   本的问题。 但以往报道的利用DNA分子机器产生dsDNA激活底物与CRISPR ‑Cas12a耦合，  均 需要PAM序列的帮助。 [0005]因此， 迫切需要开发一种基于无PAM级联TSDR和CRISPR ‑Cas12a的电化学生物传感   器来检测SARS ‑CoV‑2。说　明　书 1/5 页 3 CN 115058416 A 3