(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210703922.3 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 广东一方制药有限公司 地址 528000 广东省佛山市南海区里 水镇 旗峰工业 开发区 (72)发明人 索彩仙　潘礼业　黄上书　谭斯尹　 林晗　罗宇琴　陈向东　孙冬梅　 沈斌斌　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 李素兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种僵蚕及炒僵蚕提取物的多重特异性PCR 鉴别方法及其在中成药鉴定中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及 其饮片、 水提物制品和配方颗粒多重PCR鉴别的 引物， 其包括第一引物对和第二引物对； 其中， 所 述第一引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO： 1 所示， 其下游引物的序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所 述第二引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO： 3 所示， 其下游引物的序列如SEQ  ID NO： 4所示。 本 发明还公开了上述引物的应用， 基于该引物的试 剂盒以及基于该引物的鉴别方法。 实施本发明， 可有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物 制品和配方颗粒的真伪。 权利要求书2页 说明书13页 序列表1页 附图2页 CN 114990230 A 2022.09.02 CN 114990230 A 1.一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒多重PCR鉴别的引物， 其特征在于， 包括第一引物对和第二引物对； 其中， 所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO： 1所示， 其下游引物的序列如 SEQ ID NO： 2所示； 所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO： 3所示， 其下游引物的序列如SEQ  ID  NO： 4所示。 2.如权利要求1所述的引物在(1)、 (2)、 (3)或(4)中的应用： (1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪的应用； (2)鉴定含有僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒的中成药的真伪的应 用； (3)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒的试剂盒； (4)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法 中的应用。 3.根据权利要求2所述的鉴定僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪 的应用， 其特征在于， 所述应用为同时鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和 配方 颗粒是否来源于家蚕和白僵 菌。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 其包括如权利要求1所述的引物。 5.一种快速鉴别 僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 提取待测样品的基因 组DNA； S2、 以所述基因组DNA为模板， 采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增， 得到扩增产 物； S3、 将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 以判断待测样品的真伪。 6.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特 征在于， 步骤S1中， 采用如下 方法提取待测样品的基因 组DNA： 取待测样品， 加入CTAB沉淀液沉淀提取1～3次； 取沉淀物加入CTAB提取液、 蛋白酶K、 β ‑ 巯基乙醇提取， 然后加入氯仿 ‑异戊醇萃取1～3次； 取萃 取后上清液， 加入异丙醇或异丙醇 ‑ 乙酸钠沉淀提取， 沉淀物经洗涤、 孵 育后用水 溶解， 即得待测样品的基因 组DNA。 7.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特 征在于， 步骤S2中包括： 以所述基因组DNA为模板， 采用所述第一引物对、 第二引物对进行PCR扩增， 得到扩增产 物。 8.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述P CR扩增的程序为： 将扩增体系在94～96℃的温 度下预变性4～6min， 然后在预设程序下循环38～45次， 最后在71～75℃延伸4～6mi n； 其中， 所述预设程序为： 先在94～96℃的温度下变性20～40s， 随后在50～56℃的温度 下退火20～40s， 再在6 5～80℃的温度下延伸20～40s。 9.如权利要求7所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系为： 2 ×Taq PCR Mix 10～15 μL， 所述权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990230 A 2第一引物对的上游引物0.3～0.7μL， 所述第一引物对的下游引物0.3～0.7μL， 所述第二引 物对的上游引物0.3～0.7μL， 所述第二引物对的下游引物0.3～0.7μL， DNA模板0.5～2.5 μ L， 灭菌双蒸水补足至25 μL。 10.如权利要求9所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒 真伪的鉴定方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系为： 2 ×Taq PCR Mix 12.5 μL， 所述 第一引物对的上游引物0.5 μL， 所述第一引物对的下游引物0.5 μL， 所述第二引物对的上游 引物0.5 μL， 所述第二引物对的下游引物0.5 μL， DNA模板1 μL， 灭菌双蒸水补足至25 μL。 11.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒 真伪的鉴定方法， 其特 征在于， 步骤S3中包括： 将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 若所述扩增产物在163bp处产生条带， 则待 测样品中含有家蚕； 若在26 0bp处产生条 带， 则待测样品中含白僵 菌； 所述待测样品中同时含有家蚕和白僵菌时， 所述待测样品为真品； 否则待测样品为伪 劣品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990230 A 3