(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221076461 1.8 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 广州达安基因股份有限公司 地址 510665 广东省广州市高新 技术开发 区香山路19号 (72)发明人 蒋析文　刘悦　杨迪　董子维　 郑志东　黄婷婷　 (74)专利代理 机构 上海助之鑫知识产权代理有 限公司 31328 专利代理师 陈详 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种乙型肝炎病毒RNA检测试剂盒及方法 (57)摘要 本发明提供了一种乙型肝炎病毒RNA检测试 剂盒及方法， 具体地， 本发明基于多重实时荧光 定量PCR开发了检测乙型肝炎病毒RNA(HB V RNA) 的试剂盒及方法。 可广泛应用于HBV病毒引起的 乙型肝炎的临床诊断和疗效跟踪， 以及疫情防控 等领域。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图3页 CN 115125334 A 2022.09.30 CN 115125334 A 1.一种用于检测乙型肝炎病毒RNA(HBV  RNA)的PCR引 物对组， 所述引 物对组包括第一 引物对， 所述第一引物对包括如SEQ  ID NO.:1所示的正向引物， 如SEQ  ID NO.:2所示的反 向引物， 和如SEQ  ID NO.:3所示的逆转录引物； 优选地， 所述引 物对组还包括第二引 物对， 所述第二引 物对包括如SEQ  ID NO.:5所示 的正向引物； 和， 如SEQ  ID NO.:6所示的反向引物。 2.一种用于检测乙型肝炎病毒RNA(HBV  RNA)的探针组， 所述探针组包括： 如SEQ  ID  NO.:4所示的针对乙型肝炎病毒的特异性的探针； 优选地， 所述探针组还 包括： 如SEQ  ID NO.:7所示的内标探针。 3.一种用于检测乙型肝炎病毒RNA的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1 所述的PCR引物对组。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括权利要求2所述的探针 组。 5.如权利 要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括HBV  RNA应液A， 所述HBV   RNA反应液A包括权利要求1所述的PCR引物对组和权利要求2所述的探针组。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括HBV  RNA反应液B， 所述 HBV RNA反应液B包括选自下组的一种或多种组分： dUTPs、 Taq酶、 逆转录酶、 UDG酶、 RNA酶抑制剂。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括DNA消化试剂， 所述DNA 消化试剂包括DNA酶I和DNA酶Ibuf fer。 8.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阴性质控品， 和阳性质 控品。 9.一种检测乙型肝炎病毒RNA的方法， 其特 征在于， 所述方法包括 步骤： (1)提供待检测样本， 所述样本中含有HBV  RNA； (2)使用DNA酶I对所述样本核酸DNA进行消化； (3)制备扩增反应 体系， 进行扩增反应， 检测样本中的HBV  RNA： 其中， 所述扩增反应体系包括步骤(2)处理过的待检测样本、 权利要求1所述的引物对 组、 和权利要求2所述的探针组。 10.权利要求1所述的引物对组、 和权利要求2所述的探针组 的用途， 用于制备检测试剂 盒， 所述检测试剂盒用于乙型肝炎病毒RNA(HBV  RNA)检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125334 A 2一种乙型肝炎病毒RNA检测试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体地说， 本发明涉及一种乙型肝炎病毒RNA检测试剂 盒及方法。 背景技术 [0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis  B virus,HBV)是一种嗜肝病毒， 主要存在于肝细胞内 并损害肝细胞， 是导致慢性乙型肝炎、 肝硬化、 肝衰竭和肝细胞癌的主要致病因素。 乙型肝 炎病毒感染是全球性的公共卫生问题。 全球肝硬化和肝细胞癌患者中， 由HBV感染引起的比 例分别为30％和45％。 我国肝硬化和肝细胞癌患者中， 由HBV感染引起的比例分别为60％和 80％。 HBV造成的疾病负担非常沉重， 其防治工作面临严峻的挑战。 [0003]乙型肝炎病毒RNA(HBV  RNA)由感染肝细胞核内的的共价闭合环状DNA (covalentl y closed circular DNA， cccDNA)转录产生， 所以理论上血液HB V RNA病毒颗 粒 的存在以及其病毒颗粒的水平可以反映cccDNA的状态， 包括cccDNA的水平及其转录活性。 这使得HBV  RNA检测有可能代替cccDNA 检测作为抗病毒治疗的关键点。 经实验证明， cccDNA 转录为RNA经核衣壳包裹后以病毒样颗粒形式释放， 这个过程不被核苷酸/核苷类药物 (NAs)治疗所阻断， 故在慢性乙肝患者血液中检测不到HBV  RNA时， 说明患者肝细胞内的 cccDNA消失或者 转录静默停止， 意味着此时可以停止用药。 [0004]目前荧光PCR法检测有两类靶标， 一个是检测HBV  DNA， 另一个是检测HBV  RNA。 HBV  DNA主要用于评估HBV感染者病毒复制水平， 是抗病毒治疗适应证选择及疗效判断的重要指 标， 应用广泛。 但目前应用于治疗HBV的口服药物如 恩替卡韦、 拉米夫定以及 核苷类、 核苷 酸 类药物虽然可有效降低外周HBV  DNA载量， 但对肝细胞内的c ccDNA无明确作用。 [0005]HBV RNA可以反映cccDNA的水平及其转录活性， 由于核苷(酸)类药物的影响， 即使 血液中检测不到HBV  DNA， 由于cccDNA的持续存在， 血液中仍存在HBV  RNA， 故血液中的HBV   RNA在监测抗病毒疗效方面具有临床意 义。 发明内容 [0006]本发明的目的在 于提供一种高准确性和灵敏度的HBV  RNA检测测试剂盒及检测方 法。 [0007]本发明的第一方面， 提供了一种用于检测乙型肝炎病毒RNA(HBV  RNA)的PCR引物 对组， 所述引物对组包括第一引物对， 所述第一引物对包括如SEQ  ID NO.:1所示的正向引 物， 如SEQ ID NO.:2所示的反向引物， 和如SEQ  ID NO.:3所示的逆转录引物。 [0008]在另一优选例中， 所述引物对组还包括第二引物对， 所述第二引物对包括如SEQ   ID NO.:5所示的正向引物； 和， 如SEQ  ID NO.:6所示的反向引物。 [0009]本发明的第二方面， 提供了一种用于检测乙型肝炎病毒RNA(HBV  RNA)的探针组， 所述探针组包括： 如SEQ  ID NO.:4所示的针对乙型肝炎病毒的特异性的探针。 [0010]在另一优选例中， 所述探针组还 包括： 如SEQ  ID NO.:7所示的内标探针。说　明　书 1/10 页 3 CN 115125334 A 3