(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210976154.9 (22)申请日 2022.08.15 (71)申请人 北京爱普益 生物科技有限公司 地址 100174 北京市大兴区北京经济技 术 开发区地盛东路1号院爱普益大厦 (72)发明人 梁环环　王丹　李鑫　邱笑违　 (74)专利代理 机构 北京圣州专利代理事务所 (普通合伙) 11818 专利代理师 朱芳斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种乙型肝炎病毒DNA一站式检测的试剂盒 及应用 (57)摘要 本发明公开了一种乙型肝炎病毒DNA 一站式 检测的试剂盒及应用， 所述试剂盒包括A管和B 管， A管含有HBV  DNA定量引 物组、 YMDD耐药突变 引物组和A管内标引物组； B管含有HBV基因型引 物组和B管内标引物组。 本发明实现了简单、 快 速、 高效的对乙肝病毒样本进行全面分析， 可作 为乙型肝炎感 染者临床诊 疗的辅助指标之一。 权利要求书2页 说明书14页 附图4页 CN 115418412 A 2022.12.02 CN 115418412 A 1.一种乙型肝炎病毒DNA一站式检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括A管和B 管， A管含有HBV  DNA定量引物组、 YMDD耐药突变引物组和A管内标引物组； B管含有HBV基因 型引物组和B管内标引物组； 其中 所述HBV DNA定量引物组包括： 正向引物(F)： CATGCGYG GRACCTTTSYGK； 反向引物(R)： GCGAGCRA AACARGCNGCWA； 荧光探针(P)： TC CTCTKCCGATCCATACTGCG G， 且该探针5'端为FAM， 3'端为BHQ1； 所述YMDD耐药突变引物组包括： 正向引物(F)： TAG GGCTTTCCCCCACTGT； 反向引物(R)： TG GCCCCCAATACCACAT； YIDD探针(Pi)： TG GCTTTCAGTTATATTGAT， 且该探针5'端为ROX， 3'端为MGB； YVDD探针(Pv)： TG GCTTTCAGTTATGTGGAT， 且该探针5'端为C Y5， 3'端为MGB； 所述A管内标引物组包括： 正向引物(F)： CGCTC CCGTTCTAAGTTCCA； 反向引物(R)： ACGC CTGGGATCGCTGCA ACA； 荧光探针(P)： ACTG GCTACTGATCGCA AAGC， 且该探针5'端为VIC， 3'端为BHQ1； 所述HBV基因型引物组包括： 正向引物(F)： CAGT TGGACCCTGCATTCAA； 反向引物(R)： C CTTGTTGGGATTGAAGTCCC； B型探针(Pb)： C CAACTCAGAAAATC， 且该探针5'端为FAM， 3'端为MGB； C型探针(Pc)： C CAACTCAAACAATC， 且该探针5'端为ROX， 3'端为MGB； D型探针(Pd)： CA AACACCGCAAACC， 且该探针5'端为C Y5， 3'端为MGB； 所述B管内标引物组： 正向引物(F)： CGCTC CCGTTCTAAGTTCCA； 反向引物(R)： ACGC CTGGGATCGCTGCA ACA； 荧光探针(P)： ACTG GCTACTGATCGCA AAGC， 且该探针5'端为VIC， 3'端为BHQ1。 2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒DNA一站式检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒需要 进行PCR反应， 包括： 核酸提取， 将含有靶核酸的临床样本经裂解细胞或病 毒颗粒， 释放核酸后， 利用硅磁珠 与核酸结合、 释放的原理， 通过漂洗、 洗脱过程得到高纯度的核酸； 核酸扩增， 将A管的引物、 探针分别与缓冲液、 镁离子、 dNTPs、 Taq酶、 UDG酶按比例混合， 构成PCR预混液1； 将B管的引物、 探针分别与缓冲液、 镁离子、 dNTPs、 Taq酶、 UDG酶按比例混合， 构成PCR预 混液2； 利用上述组分 分别建立 40 μL PCR反应体系。 3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒DNA一站式检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒还设有质控品， 所述质控品包括内标、 阳性对照A、 阳性对照B、 阴性对照和4个工作标准 品； 其中 所述内标含内标序列的克隆质粒， 用于监控核酸 提取和扩增过程；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115418412 A 2所述阳性对照A含有定量YIDD、 定量YVDD突变型扩增靶序列的灭活血清样本， 用于排除 假阴性； 所述阳性对照B含B型、 C型、 D型扩增靶序列的灭活血清样本， 用于排除假阴性； 所述阴性对照含有HBV  DNA阴性血清， 用于排除假阳性； 4个工作标准品含有定值的含HBV扩增靶序列的系列灭活血清样本， 用于建立标准曲 线。 4.一种利用如权利要求1所述的乙型肝炎病毒DNA一站式检测的试剂盒， 其特征在于， 用于乙型肝炎病毒的检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115418412 A 3