(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210728014.X (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 湖南农业大 学 地址 410128 湖南省长 沙市芙蓉区农大路1 号 (72)发明人 王晓清　曾嘉伟　曾丹　胡亚洲　 秦溱　葛玲瑞　徐大建　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 公茂海 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引 物和应用 (57)摘要 本发明公开了一种中华鳖遗传性别连锁的 SNP标记及其引物和应用， 所述SNP标记为SEQ  ID  NO:1序列自5 ’端起第311位、 第329位和第332位 碱基， 所述三个标记在雄性中基因型为AA、 CC和 CC， 在雌性中基因型为AG、 AC和CT。 根据等位基因 特异性PCR(allelespecific  PCR， AS‑PCR)原理 设计引物， 三个SNP标记较近因此设计在同一条 引物上， 可以极大确保引物与模板地特异性结 合， 避免假阳性的情况。 通过这三个SNP标记及所 设计的引物， 可以不受中华鳖 组织特异性和环境 影响， 快速简单地鉴定各年龄阶段的中华鳖遗传 性别， 对研究中华鳖性别决定和分化机制、 实现 其性别控制具有重要意义， 对中华鳖单性群体选 育提供了极大便利， 应用前 景广阔。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 115232882 A 2022.10.25 CN 115232882 A 1.一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记， 包括三个SNP标记， 其特征在于， SNP标记所在 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 三个所述SNP标记分别位于SEQ  ID NO:1所示序列第第 311位、 第32 9位和第3 32位碱基。 2.根据权利要求1所述的一种中华鳖遗传性别连锁 的SNP标记， 其特征在于， 三个所述 SNP标记在雄 性中基因型为A A、 CC和CC， 在雌性中基因型为AG、 AC和CT。 3.根据权利要求1 ‑2任一所述的一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记鉴定用引物， 其特 征在于， 所述引物包括正向引物(5953 ‑1F)、 反向引物(5953 ‑1R)和SNP标记特异性引物 (5953‑1FS)， 所述引物的核苷酸序列为SEQ  ID NO:2‑4所示。 4.根据权利要求3所述的一种中华鳖遗传性别连锁 的SNP标记及其引物， 其特征在于， 在鉴定中华鳖遗传性别中的应用。 5.根据权利要求4所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提 取中华鳖基因组DNA； 将待测中华鳖的基因组DNA进行PCR扩增， 获得PCR扩增产物； 对所述 PCR扩增产物进行电泳检测， 根据PCR扩增条 带的数目及大小来确定中华鳖的遗传性别。 6.根据权利要求5所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反 应体系为： DNA模板1 μL； 正向引物0.2 μL； 反向引物0.5 μL； SNP标记特异性引物0.8 μL； Vazyme   2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL； 灭菌水补至25 μL。 7.根据权利要求5所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反 应条件为： 95℃3min； 9 5℃20S， 69℃2 0S， 72℃2 0S， 5个循环； 9 5℃20S， 67℃20S， 72℃2 0S， 5个 循环； 95℃20S， 65℃20S， 72℃20S， 5个循环； 95℃20S， 63℃20S， 72℃20S， 15个循环； 72℃ 5min。 8.根据权利要求5所述的中华鳖遗传性别的鉴定方法， 其特征在于， 若电泳结果显示单 条带则中华鳖为 雄性， 若双条 带则中华鳖为雌性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115232882 A 2一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 尤其涉及一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记 及其引物和应用。 背景技术 [0002]爬行动物的性别决定研究具有重大的理论意义与生产应用价值， 多年来一直属于 研究的热点， 备受产业和学界的关注。 目前来说爬行动物的性别决定可分为基因型性别决 定(Genetic  sex determination,GSD)和环境型性别决定(Environmental  sex  determination,ESD)。 但至今为止还有许多动物的性别决定机制仍不明确， 爬行动物中的 龟鳖类就是非常典型的一类。 [0003]中华鳖(Pelodiscus  sinensis)又名甲鱼、 水鱼、 团鱼、 脚鱼等， 隶属于爬行纲 (Reptilia)、 龟鳖目(Tesudines)、 鳖科(Trionychidae)、 鳖属(Pelodiscus)， 是我国重要的 名特优水产养殖品种。 中华鳖肉质鲜美， 特别是其宽厚的裙边， 有着丰富的胶原蛋白， 含多 种氨基酸， 口感独特 软糯， 广受消费者青睐， 因此 具有较高的经济价 值。 [0004]而中华鳖作为龟鳖类 的主要养殖品种之一， 具有性别二态性， 但早期胚胎及稚鳖 期外部生物学特征没有肉眼可辨的差异， 给中华鳖相关研究带来了一定困难， 中华鳖雄性 个体不论生长速度还是个体大小均优于雌性个体， 为提高养殖效益， 需要找到一种 可靠的 雌雄鉴定方法。 发明内容 [0005]1.要解决的技 术问题 [0006]本发明的目的是为了解决现有技术中中华鳖早期胚胎及稚鳖期外部生物学特征 没有肉眼可辨的差异的问题， 而提出 的一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物和 应 用。 [0007]2.技术方案 [0008]为了实现上述目的， 本发明采用了如下技 术方案： [0009]一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记， 包括三个SNP标记， SNP标记 所在的核苷酸序 列如SEQ ID NO:1所示， 三个所述SNP标记分别位于SEQ  ID NO:1所示序列第第311位、 第329 位和第332位碱基。 [0010]优选地， 三个所述SNP标记在雄性中基因型为AA、 CC和CC， 在雌性中基因型为AG、 AC 和CT。 [0011]本发明还提出了一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记鉴定用引物， 所述引物包括 正向引物(5953 ‑1F)、 反向引物(5953 ‑1R)和SNP标记特异性引物(59 53‑1FS)， 所述引物的核 苷酸序列为SEQ  ID NO:2‑4所示。 [0012]本发明还提出了一种中华鳖遗传性别连锁的SNP标记及其引物， 在鉴定中华鳖遗 传性别中的应用。说　明　书 1/4 页 3 CN 115232882 A 3